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分子克隆-蛋白表达实验指南（五）

2020.7.27

8. TA质粒转化菌落的验证
与表达载体的验证不同，转化TA质粒时不用双酶切验证。只需用目的基因引物和TA载体引物PCR验证即可。TA载体引物PCR片段比插入片段大约长150bp。
目的基因退火温度与之前胶回收时温度相同，TA退火温度60C即可，但可在55～70之间变动，不会影响结果。
挑取至少6个白色克隆于6个含4ml抗性的LB培养基的灭菌试管中37C过夜摇菌。
       取摇约2h时的菌液1ul作为模板，Taq
PCR（30ul）验证（验证时条件等应与以前一致）。取菌液时应在超净台中进行，以便PCR验证为阳性后可以直接对相应的菌落进行小量质粒抽提。最好不用菌落直接PCR，避免由于质粒粘附在细菌表面而引起的假阳性。对PCR验证后阳性的细菌小抽
       验证时所用的control及样品：
       1．白色菌落T载体引物PCR
       2．白色菌落目的基因引物PCR
       3．蓝色菌落T载体引物
       4．1中T载体引物PCR、胶回收后，用回收产物做模板，目的基因为引物PCR，进一步验证
9．小量质粒抽提
采用上海博采生物工程有限公司提供的小量质粒快速抽提试剂盒，操作步骤如下：
1．取菌液1.5ml，高速离心10000g 1min 收集菌体。可以在初次离心后弃上清再加入相同的菌液，增加小抽的细菌数量，提高最终质粒的浓度。
2．弃上清，沉淀中加入100ul S1，振荡至彻底悬浮。
3．加200ul
S2，立即上下颠倒，使细菌裂解，室温放置2min至溶液澄清。（使用前先观察S2中是否有沉淀，室温低时S2中SDS会沉淀，此时40C水浴使之融解）
4．加400ul S3，立即上下颠倒5－10次，使充分中和，室温放置2min。
5．15000rpm，10min
6．将上清转移到2ml样品收集管和3S柱中，室温放置2min，10000rpm，1min。转移上清时切忌吸取蛋白沉淀。
7．取下3S柱，弃废液，将3S柱置入同一支收集管中，吸取700ul Wash Solution到3S柱，12000rpm，1min。（用Washing
Solution前先确认其是否加了乙醇，不加乙醇的WS会将质粒洗脱）
8．重复step7
9．取下3S柱，弃废液，10000rpm，1min。
10．将3S柱置于干净的1.5ml离心管中，在膜中央加30-50ul
TE或水，加盖50C水浴2min，然后15000rpm，1min。离心后液体-20C保存。