双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-2
2．[操作步骤]
1. 将研磨管离心一分钟（不低于12000×g）弃上清。
2. 加入裂解液（200-300ul）充分vortex.
3. 再加入样品鼠脑组织（低于100mg）充分研磨。然后可以再加入裂解液至1ml..
4. 将组织悬液离心5-10min(高于12000g)去除树脂和细胞碎片。
5. 收集上清。
3．[试剂准备]
1.研磨管
2.裂解液：称取尿素4.8g、CHAPS0.4g、PMSF100mg，用纯水溶解至10ml，分装成500μl 于-20℃储存，使用时，每500μl液体加DTT5mg,IPGbuffer10μl。
三、蛋白质定量
1．[基本原理]
定量作为生物实验室的日常工作之一，具有非常重要的意义。在蛋白质组学研究中，我们常常需要对蛋白质进行快速定量。无论是对蛋白质表达谱的定量比较还是蛋白质理化性质的分析，都建立在准确的定量这一基础之上。蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。表-1为五种蛋白质的测定方法的比较。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。
表-1 五种蛋白质测定方法的比较
| 方法 | 灵敏度 | 原理 | 干扰物质 |
| 凯氏定氮法（Kjedahl法） |
0.2～1.0mg |
将蛋白质转换为氮，用酸吸收后滴定 | 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） |
| 双缩脲法 （Biuret法） |
1～20mg |
多肽键加碱性铜离子生成紫色络合物 | 硫酸铵， Tris缓冲液和某些氨基酸 |
| Folin-酚试剂法 （Lowry法） |
5μg |
磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和 Phe还原 | 硫酸铵， Tris缓冲液，甘氨酸，各种硫醇 |
| 考马斯亮蓝法 (Bradford法) |
1～5μg |
考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其λmax由465nm变为595nm | 强碱性缓冲液，TritonX-100,SDS |
| 紫外吸收法 |
50～100μg |
蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 | 各种嘌呤和嘧啶，各种 核苷酸 |
由于DNA具有的5'-磷酸腺嘌呤 ，5'-磷酸胞密啶和5'-磷酸鸟嘌呤在紫外光谱的260
nm处产生很灵敏的特征峰，我们可以以此对DNA进行定量测定。相似的，由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，所以任何一个蛋白质都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，我们可以对其进行定量。但该法存在无法弥补的缺陷。首先，对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。其次，若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
另一种可供选择的蛋白质定量方法为Lorry法。其原理为，蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。
实验室通常采用改良的Bradford法进行测定蛋白质含量。其原理为，蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。只需将eppendorf管换为ELISA板并相应的减少各个试剂的用量，这种方法可以应用到大规模高通量的试验中，可以同时进行384个样品的全自动准确定量
-
技术原理
