双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-6
我们本次实验使用的是银染。银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。
由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1
ng/蛋白质点，故广泛的用在2D凝胶分析上。待找到自己感兴趣的蛋白质点后，再通过考染富集该目的点，然后做进一步的肽段指纹图谱分析（PMF）或序列测定。随着质谱技术的不断完善和发展，对银染后的f
mol级的蛋白质点直接测定已非难事。
2．[操作步骤]
♥ 固定
1) 每条胶用150 mL固定液（ 50% 甲醇 和 5% 乙酸）固定20 min。
2) 150 mL 50% 甲醇冲洗10 min，
3) 去离子水冲洗10min。
♥ 敏化
4) 150 mL 0.02%硫代硫酸钠敏化1 min。
5) 超纯水漂洗2次，每次1min。
♥ 银染
6) 将胶条浸入 150mL 0.1%硝酸银和 0.08% 甲醛 (37%) 20 min。
7) 超纯水漂洗两次，每次1min。
♥ 显色，需要新鲜配制
8) 150 mL 2% 碳酸钠和0.04%甲醛 (37%)浸泡 直至显色。
♥ 终止
9) 胶条用150 mL 5%醋酸冲洗10 min。
10) 超纯水冲洗，
♥ 保存
扫描完毕的胶可用保鲜膜包好于4℃下保存。
3．[试剂准备]
1. 甲醇、醋酸、甲醛、均需用分析纯。
2. 0.02% 硫代硫酸钠:：每张胶, 称取 30mg 硫代硫酸钠﹒5H2O 用去离子水溶解至终体积150 mL 。
八、2-DE凝胶的检测
目测或通过计算机辅助自动化检测：
（1）目测：是比较精确的，蛋白质斑点强度有10%的变化就可以可靠地检测出来。对不同凝胶上寻找对应斑点时，目测比自动匹配要容易得多。而且，目测也不要昂贵的软件和硬件，但随着需要检测的蛋白质斑点的增多、凝胶的增大，目测工作也越来越繁重。要在20块30
cm´40cm的凝胶中比较一个蛋白质斑点的强度几乎不可能；
（2）自动化检测：通过监视器把感兴趣的斑点放在20个窗口中比较，同时也可控制计算机强度差值。对自动化检测来说，最好的凝胶质量、最佳的斑点检测参数以及交互式人机对话是必要的。其过程分为5步：1）扫描数据的数字化；2）背景和污点的校正；3）斑点的检测；4）定量表示；5）不同凝胶的匹配比较。
（3）2-DE的数据库来自2-DE凝胶上蛋白质减法分析（附加斑点、丢失斑点、强度差异）、鉴定和特性的大量数据储存在2-DE数据库中，在Electrophoresis杂志上每年发表一次，其中部分数据可在互联网上通过WWW技术获得。例如：人类心脏蛋白质2-DE数据库中有3239个蛋白质，到目前为止，已有66个被注册。在这个数据库中，注释所使用的标准有：扩张性心肌病相关蛋白质、N末端序列、内部序列、氨基酸组成、蛋白质名称、分子量、等电点以及与鉴定有关的参照。可将其从这个数据库直接转到我们的数据库进行比较.
