双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-3
2．[操作步骤]
1. 将标准品BSA(5mg/ml)先稀释成0.5 mg/ml，
2. 按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl分别加到96孔板中，加DDW补足到20μl。
3. 加适当体积样品（4μl）到96孔板的样品孔中，加DDW到20μl。
4. 各孔加入200μl G-250染色液，室温放置3-5分钟。
5. 用酶标仪测定A595，或560-610nm之间的其它波长的吸光度。
6. 根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。
3．[试剂准备]
1. BSA标准牛蛋白血清5mg/ml
2. ELISA96孔板
3. DDW
4. G-250染色液
四、第一向：等电聚焦
1．[基本原理]
从电泳观点看，蛋白质最主要的特征是它的带电行为。蛋白质是由20种不同的氨基酸按不同比例通过肽键的连接构成的。由于蛋白质的一些氨基酸侧链在一定的pH值的溶液中是可解离的，从而带有一定的电荷。构成蛋白质的所有氨基酸残基上所带正负电荷的总和便是蛋白质所带的净电荷。蛋白质在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电，在低pH时，蛋白质的净电荷是正的，在高pH时，其净电荷是负的，但在某一pH时，它的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoelectric
pointpI）。蛋白质的等电点值取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。组成每一种蛋白质或多肽的氨基酸的数目和比例是不同的，因此蛋白质的等电点范围很宽，如某种α-酸性糖蛋白（chimpanzee）的pI可低达1.8，而人胎盘溶菌酶的pI可高达11.7，这样宽广的pI范围使得可以利用它来进行蛋白质的分离和分析。
等电聚焦电泳时，形成正极为酸性，负极为碱性的连续的、稳定的pH梯度。将某种蛋白质（或多种蛋白质的混合物）样品至于负极端时，因pH＞pI，蛋白质分子带负电，电泳时向正极移动；在移动过程中，由于pH逐渐下降，蛋白质分子所带的负电荷量逐渐减少，蛋白质分子移动速度也随之变慢；当pH＝pI时，蛋白质所带的净电荷为零，蛋白质即停止移动。同理当蛋白质样品至于阳极端时，因pH＜pI，蛋白质分子带正电，电泳时向负极泳动，移动过程中，pH不断升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，速度也随之减慢，直到到达净电荷为零的等电点位置则停止移动。因此在一个有pH梯度的环境中，对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，则在电场作用下，不管这些蛋白质分子的原始分布如何，各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦，经过一定时间的电泳以后，不同等电点的蛋白质分子会分别聚集于其相应的等电点位置，这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。各种不同的蛋白质在电泳结束后，形成很窄的一个区带，很稀的样品也可进行分离。在等电聚焦中蛋白质区带的位置，是由电泳的pH梯度的分布和蛋白质的pI所决定的，而与蛋白质分子的大小和形状无关。
蛋白质到达它的等电点位置后，没有净电荷，就不能进一步迁移。如果蛋白带向阴极扩散，将进入高pH范围而带负电，阳极就会将其吸引回去，直到回到净电荷为零的位置，同理，如果它向阳极扩散而带正电，阴极则将其吸引回净电荷为零的位置。因此蛋白质只能在它的等电点位置会被聚集成一条窄而稳定的带（见图-1）。所以等电聚焦不仅能获得不同蛋白质分离和纯化效果，同时也能得到蛋白质的浓缩效果。这种〝聚焦效应〞或称〝浓缩效应〞是等电聚焦最大的优点，是高分辨率的保证。
根据建立pH梯度原理的不同，梯度又分为载体两性电解质pH梯度（Carrier ampholytes pH
gradients）和固相pH梯度（immobilized pH
gradients）。前者是在电场中通过两性缓冲离子游离建立pH梯度（线性）。后者是将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质的一部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨率比前者高一个数量级
