双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-5
六、第二向 SDS-PAGE
1．[基本原理]
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂和强还原剂后具有这种作用并建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。之后，Weber，Glossmann和Douglas等人进行了多次改进，已显示出了在分离、鉴定和纯化蛋白质方面的优越性。
SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子还原剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能够断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级结构和三级结构。强还原剂，例如β-巯基乙醇（β-mercapto
ethanal）和二硫苏糖醇（dithiothreitol，
DTT）则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS的充分结合。
当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和还原剂后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成蛋白质-SDS
复合物,这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质分子穿上了带有负电荷的“外衣”。蛋白质-SDS复合物所带的SDS负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，另一方面，蛋白质-SDS复合物的形状是类似于“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度是恒定的，约为18埃，而长轴的长度则与蛋白质分子量大小成比例，这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或者亚基的分子质量的大小。因此，SDS-PAGE可以按蛋白质的分子大小的不同将其
分开。当蛋白质亚基的分子质量在15kDa到200kDa之间时，电泳迁移率与分子质量的对数呈线性关系。若用已知分子量的一组蛋白质作图绘制标准曲线，在同样条件下检测未知样品，就可从标准曲线推算出未知样品的分子量。
2．[操作步骤]
1.
灌胶事先装好灌胶模具，倒入凝胶溶液。灌胶后立即在每块凝胶上铺上一层水饱和正丁醇或异丁醇，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶面。同时灌注多块凝胶时，在室温下至少聚合3个小时。聚合后倒掉覆盖在凝胶上的正丁醇溶液，并用凝胶储存液冲洗凝胶表面。暂时不用的凝胶可用塑料薄膜包好于4℃保存1-2天。将整个凝胶模具完全浸没在凝胶储存液中可4℃条件下保存1-2周。
2.
IPG胶条的转移用去离子水润洗一下胶条，将胶条的边缘至于滤纸上几分钟，去除多余的平衡液。然后将胶条放在玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG胶条轻轻的向下推，使整个胶条的下部边缘与凝胶上表面完全接触。确保在IPG胶条与凝胶表面之间及玻璃板与塑料支持膜之间无气泡产生。
3. 加入分子量标准蛋白分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，加入到IEF上样纸片上，然后将上样纸片用镊子放置在IPG胶条末端一侧，与凝胶表面接触。
4. 封顶最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液是IPG胶条被完全覆盖住，在此过程忠不要产生气泡。
5. 电泳步骤待琼脂糖凝固后，电泳槽中装满电泳缓冲液，并打开温控系统，调节温度在15℃。将胶盒插入电泳槽中，调节电泳参数，电流（mA/gel)15mA 时间（h:min) 15min ， 30mA 3h
6. 打开电源开始电泳，当溴芬兰染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。
7. 将跑好的胶转移到染色盒中固定，准备染色。
3．[试剂准备]
1. 丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液30%丙烯酰胺和0.8%甲叉双丙烯酰胺溶液，将60g丙烯酰胺和1.6g甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积不足到200ml..
2. 分离胶缓冲液1.5M Tris-HCl ,Ph8.6和0.4%（w/v）SDS：90.85g Tris和2gSDS溶于400ml去离子水中，用6N HCl调节pH到8.6，最后用去离子水将体积补足到500ml.
3. 10%（w/v）过硫酸铵溶液： 1g过硫酸铵溶于10ml去离子水中。此溶液需使用前新鲜配制。
4. TEMED
5. 覆盖液（缓冲液饱和的异丁醇）： 混合20ml上述分离胶缓冲液和30ml异丁醇，等几分
钟后去掉异丁醇层。
6. 取代液（50%(v/v)甘油和0.01%溴酚蓝水溶液）： 混合250ml甘油（100%）和250ml去离子水，再加入50mg溴酚蓝，搅拌几分钟。
7. 低熔点琼脂糖溶液：含有0.5%(w/v)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。
8. 低分子量标准蛋白
七、胶上蛋白质的检测
1．[基本原理]
显示双向凝胶上的蛋白质点的方法有多种，例如，考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)、CBB G-250、酰胺黑（Amido
Black）、丽春红S(Ponceau S)
、银染、负染、荧光染料染色以及放射性同位素标记等。用于二维电泳常规检测和定量的普遍方法是考马斯亮蓝染色和银染。近年来由于测序技术和质谱灵敏度的提高，尤其是最新的Q-TOF类液相色谱串联质谱技术的发展，大大提高了质谱鉴定的灵敏度，从而使蛋白质显色的地位从简单的蛋白质点呈现转换为集成化的蛋白质微量化学表征过程的关键步骤。随着高灵敏度蛋白质分析方法和电泳后技术的结合，考马斯亮蓝染色和银染在蛋白质组学研究中的局限性日益暴露出来。而新的染色技术如荧光标记、同位素标记技术在提高灵敏度的同时，也与自动化的蛋白质平台切胶技术相兼容，染色技术向高灵敏度和自动化方向发展。不同的染色方法对设备和仪器要求不同，在实验中综合考虑各种因素，以选择最佳方案。下表给出了各种不同类型染色方法的灵敏度、对软硬件的要求、质谱兼容性等性能指标。见表-2。
