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组织的分离实验_胰蛋白酶消化消化分离法

2019.3.31

实验方法原理	胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。用于消化纤维性组织或较硬的癌组织则较差。Ca²⁺和Mg²⁺对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用，故需用不含这些离子的BSS 配制。血清有抑制胰蛋白酶活性的作用，因此在做细胞传代时，用胰蛋白酶消化细胞后，可不必再用Hanks 液冲洗，直接加入含有血清的培养液进行培养即可。残留的微量胰蛋白酶即被血清抑活，对细胞没有什么影响。
实验材料	新鲜组织
试剂、试剂盒	Hanks 培养液胰蛋白酶
仪器、耗材	三角烧瓶吸管
实验步骤	使用胰蛋白酶消化细胞法如下： 1. 剪切把组织剪切成3~5 立方毫米的小块； 2. 加液把组织置入三角烧瓶中（瓶内有铁蕊的搅棒或玻璃小球），注入比组织量多30~50 倍的0.25%的胰蛋白酶（预加温至37 ℃）； 3. 消化置电磁搅拌器台上，消化30~60 分钟，或置于37 ℃水浴中，或放于37 ℃温箱中；在两种情况下，每隔5~10 分钟摇动一次。如需长时间消化时，中间可更换一次消化液，然后静置三角烧瓶，过10 分钟，待组织下沉后，吸除2/3上清液，余1/3，再补加新胰蛋白酶液，继续消化； 4. 消化完毕，倒入离心管中，800 转/分，离心6~8 分钟后吸除上清液； 5. 用Hanks液漂洗2~3 分钟，离心去上清，共两次； 6. 800 转/分，离心5 分钟后去上清，加入一定量的营养液，通过100 微米/网眼的尼龙网或不锈钢纱网滤过，以除掉未充分消化的较大块的组织；如消化彻底可不过滤。用吸管吸取一滴细胞悬液滴于载物片上观察，如细胞分散良好、形态完整、即可用于培养。滤过时用3~4 层无菌纱布亦可。展开
注意事项	1. 在37 ℃温度下用胰蛋白酶长时间（1 小时以上）消化纤维性组织时，组织块表层细胞可随时从纤维网架中脱落下来。 2. 因此每隔20~30 分钟，需用不锈钢网（20~50 微米）滤过一次，离心，收集这些细胞，以免它们被消化过度受破坏。 3. 如系冷消化，在从4 ℃中取出后，亦应先滤过一次，离心，除上清，收集已游离下来的细胞；再向消化容器中寂足新胰蛋白酶液，并再重置入37 ℃温箱中，继续温消化剩余组织20~30 分钟，这样可能效果更好。展开