中国汉族泛发性雀斑样痣一家系 PTPN11 致病基因突变筛查
泛发性雀斑样痣( generalized lentiginosis， GL， OMIM:150900) 是一类以多发性黑子为突出表现， 可合并心血管疾病、智力发育迟缓、神经性耳聋、头面骨发育异常、性腺发育不全、体格矮小等异常的常 染色体显性遗传病。目前已报道的明确致病基因有PTPN11、 BＲAF、 ＲAF1 基因［1-3］，其中 90%的患者是由 PTPN11 基因突变导致［4］。2005 年我国学者 Xing 等［5］将一个泛发性雀斑样痣家族的致病基因 定位于染色体 4q21. 1-q22. 3 区域。笔者收集了一 个泛发性雀斑样痣的家系，对患者的 PTPN11 基因 外显子进行测序，现报告如下。
1 材料与方法
1. 1 临床资料 本研究中涉及的1 个家系，共调查 3 代 12 例，男 6 例，女 6 例，其中患者 3 例( 图 1) 。先证者男， 35 岁，因面部及躯干四肢出现褐色斑疹 20 余年来院就诊。20 余年前患者无明显诱因面部、 躯干四肢逐渐出现粟粒至黄豆大小棕褐色斑疹，对 称分布，无自觉症状，皮疹逐年增多，至今泛发全身 ( 图 2) 。体格检查及心脏彩超、心电图检查未见异 常。取腹部一褐色斑点行组织病理检查，结果示:表 皮黑素增多，基底层黑素细胞增多，真皮乳头及表皮 突延长，真皮上部有嗜黑素细胞( 图 3) 。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 提取 获得知情同意后，抽取 泛发性雀斑样痣患者及100 例健康对照者外周静脉 血5mL，置于 EDTA 抗凝管中，使用德国 Qiagen 公司 生产的试剂盒提取 DNA。
1. 2. 2 引物设计及 PCＲ 扩增 利用美国国立生物 技术信息中心数据库( http: / /www. ncbi. nim. gov) 获 得 PTPN11 基因序列，应用 Primer 5. 0 软件针对 PTPN11 基因的 15 个外显子自行设计 15 对引物， PTPN11 基因的第 8 个外显子引物为: F: 5'-ACTAGGAAATTGTGAAGATGGC-3'; Ｒ: 5'-GTCAGAAAACA CTGTGAAAAGC-3'。所有引物由生工生物工程( 上 海)股份有限公司合成，引物纯化后稀释为20μmol/L 备用。PCＲ 反应采用 TaKaＲa Ex Tap 试剂盒，反应 体系为 20μL，反应条件如下: 94℃预变性 5min 后， 94℃变性 30s， 59℃退火 30s， 72℃延伸 30s，共 35 个 循环， 72℃后延伸 10min。
1. 2. 3 测序 PCＲ 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测， PCＲ 纯化产物送生工生物工程( 上海) 股份有 限公司进行测序。测序结果采用 Chromas 软件( 版 本 2. 0) 对基因序列进行对比分析，确定突变位点。
图 1 泛发性雀斑样痣患者家系图( Ⅱ:1、Ⅲ3:1 为患病者，Ⅱ:1 为先证者) ;图 2 泛发性雀斑样痣患者全身分布的粟粒至黄 豆大小棕褐色斑疹; 图 3 先证者皮损组织病理示:表皮黑素增多，基底层黑素细胞增多，真皮乳头及表皮突延长，真皮 上部有嗜黑素细胞 ( HE×100)
2 结果
该泛发性雀斑样痣家系患者 PTPN11 基因的第 8 个外显子发现错义突变 c. 907G＞A( 图 4) ，使氨基 酸由正常的天冬氨酸变成组氨酸，即 p. D303H， Polyphen-2 功能预测为 possibly damaging ( score = 0. 938) 。家系内健康对照成员及100 例无亲缘关系 的正常人对照中均未发现该突变位点。
3 讨论
泛发性雀斑样痣是一种常染色体显性遗传病， 目前临床上分为发疹性黑子病和 LEOPAＲD 综合征 两种类型。前者发疹迅速，且突然，后者以多发性黑 子合并多种先天性缺陷为特征［6］。由于雀斑样痣的 皮损通常在出生时或出生后不久即出现，一般都在 成年以前发生，而内脏病变多数出现在成年后或者 更晚，仅有皮疹的泛发性雀斑样痣作为一种单独的 疾病存在还是综合征的一部分，目前尚有争议［7-8］， 本研究是对 3 例目前仅表现为多发性黑子的家系患 者进行已知致病基因的验证，来探讨其遗传学发病 机制。 遗传学研究已明确的泛发性雀斑样痣的致病机 制有 PTPN11、 BＲAF、 ＲAF1 基因，其 中90%的患者是由 PTPN11 基因突 变导致。PTPN11 基因位于染色体 12q24. 1， PTPN11 基因编码非受体 酪氨酸激酶蛋白 SHP-2， SHP-2 是 生长因子、激素及细胞因子信号通 路的重要传导蛋白， SHP-2 含有 NSH2 和 C-SH2 两个 SH2 结构域，以 及一个磷酸酶结构域 PTP［9］( 图 5) 。目前已报道的导致泛发性雀斑 样痣发生的 PTPN11 基因突变主要 集中在第 7、 12、 13 号外显子［10］，均 位于上述结构域中。 本研究是对一个仅有皮疹的泛 发性雀斑样痣家系进行热点基因突 变检测，结果家系中 3 例患者检测 到 PTPN11 基因第 8 个外显子发现的错义突变 c. 907G＞A，Polyphen-2 功能预测为 possibly damaging ( score = 0. 938) ，家系内健康对照及 100 例无亲缘关系的正常对照均未发现该突变位 点，经文献检索未发现该突变位点的报道，是 PTPN11 基因的一种新的突变位点，该位点位于 PTPN11 基因的 SHP-2 的 PTP 结构域，一般情况下 SHP-2 的活性较低， N-SH2 结构域与 PTP 结构域相 互作用，使得 PTP 活性受到抑制，当 PTPN11 基因的 8 号外显子发生错义突变时N-SH2 和PTP 结构域发 生分子内构象改变，抑制作用被打破，导致 PTP 结 构域催化活性的改变，激活下游信号传导通路，可能 参与了泛发性雀斑样痣多发黑子的发病机理［9］。 通过对该家系的遗传学研究，发现了泛发性雀 斑样痣新的可能致病基因突变，丰富了泛发性雀斑 样痣的遗传数据库。另外研究表明 PTPN11、 BＲAF、 ＲAF1 基因突变均可在部分 Noonan 综合征患者中检 测到，并且超过半数的 Noonan 综合征由 PTPN11 基 因突变所致，认为该病和 Leopard 综合征为同源等位 基因疾病［11］，一部分肿瘤患者及白血病患者身上亦 可检测到 PTPN11 基因突变，如在一些乳腺癌、胃 癌、部分幼年型粒单核细胞白血病、急性 B 淋巴细胞 白血病、儿童骨髓增生异常性疾病患者体细胞中可 检测到 PTPN11 基因突变，这也可能是泛发性雀斑样痣患者易罹患此类疾病的原因。另外相当数量散 发病例的存在，表明该病的发生与其他尚未发现的 突变基因有关。当然除遗传以外，环境因素也有导 致本病发生的可能，这些都有待进一步研究。
参考文献略。
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