cDNA链的连接、包装及转染
一：仪器:同cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成
二：试剂:EcoRⅠ连接子试剂盒
三：操作:
1:cDNA加接头反应
a:按下表准备反应体系
10×缓冲液T4DNA连接酶3μl
BSA 3μl
cDNA 2.5μl
连接子 1μl
T4DNA连接酶 1μl
加水至 30μl
b: 15℃保温6-18小时
c:70℃加热10分钟后放置于冰浴
2:磷酸化反应
a:按下表准备反应体系
上述1.a反应物 30μl
T4磷酸激酶10×缓冲液 4μl
0.1mM ATP 2μl
T4激酶(10μ/μl) 1μl
水 3μl
总体积 40μl
b:37℃保温30分钟。用DNA纯化柱纯化带接头的cDNA
c: 用1ml Sephacryl S-400装柱，TEN缓冲液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min
d: 上样,用1mlTEN缓冲液洗柱2次,收集洗脱液。洗脱时加套管，800g5min
e：合并洗脱液.
D：3M NaAC和无水乙醇沉淀，干燥复溶
3:cDNA与载体联接：
a:准备4个离心管,按下表加入
A B C D
载体DNA0.5ug/ul) 2
cDNA(10ng/ul) 0 32 1
10×T4DNA连接酶缓冲液 1
水 6 3 4 5
T4DNA连接酶 1
b:保温，室温:3小时;4℃过夜
4:体外包装：
a：从－７０℃取出包装蛋白，冰浴中溶化，每管50ul
b：包装蛋白混合液完全溶化后，立即加入10ul“3.a”中的连接液，轻弹管壁，轻轻混匀。
c：22℃（室温）放置3小时
d：上述包装混合液中加入445ul的phage缓冲液和25ul氯仿，轻轻混匀，冰浴保存。（包装液4℃下可存放7天）
5：感染
a：灭菌培养皿中倒入下层LB培养基，凝固后，37℃保温
b；安1：1000的比例稀释“4”中的包装混合液。
c：取100ul稀释液和100ul菌株（Y1090、LE392）
d：取4ml熔化45℃保温的上层培养基加入到“c”中的混合液中，混匀后铺板在37℃预热的下层培养基上，37℃过夜。
6：收集和扩增文库
构建的cDNA文库经扩增后，才能保存和进行长期筛选。本文库由λgt11作为载体而构成，因此扩增时应在大肠杆菌Y1090中进行。
a：在过夜后的培养皿上挑取出现的噬菌斑，加2－3mlSM缓冲液，室温震荡２小时。４℃7000g离心30min,以除去细胞碎片，分装上清，溶解噬菌斑，4℃8000－10000g快速离心10min，以除去细胞碎片和培养基成分。
b：重复上步操作
c：上清液转入一新管 中，如要在4℃短期保存则按１ml上清中加入20-30μl的比例加入氯仿，4℃保存；如要长期保存则应加入终浓度为７％的二甲基亚砜，于－70℃保存。以被需要时重新涂板筛选文库。。
总结：C文库构建的简单流程为：
RNA－mRNA－cDNA单一链的合成－cDNA单二链的合成－加接头－与载体连接－体外包装－转染－筛选文库（见总RNA的提取(试剂盒法、氯化锂法和蛋白酶－热酚法)、mRNA的提取及纯化（磁珠法和亲和柱层析法）、cDNA文库构建技术-cDNA链的反转合成）
