分析细胞学技术-2
显微吸收光度测量需满足朗伯-比尔定律条件，待测物质需为均质，但生物学物质很少是均质的，而且显微镜成像过程中，经过光路系统各界面多次折射反射后会导致测量中的分布误差、闪烁误差、系统误差等，影响测量精度。所以除校正系统至最佳状态外，常用双波长法、一波二区法和扫描法来消除误差。扫描法是最令人满意的方法。测量时，先将待测物分成大量小区域，近似认为每个小区域内物质分布为均质，采用顺序逐点扫描法测出各小区域的消光度，经积分后换算出待测物的总消光度，求得其相对含量。扫描法根据不同扫描方式可分为：飞点扫描、像扫描、物扫描、TV扫描等。在实际测量时，台物扫描是最常用的方法，在高精度扫描台上放好样品，确定其扫描范围和波长，根据放大倍数确定测量光栏的大小，根据待测物确定单色入射光波长，选取全自动扫描后由计算机数据处理并显示结果及扫描图形。台物在x方向和y方向上来回移动，而测量光栏位置不动，使台上的被测物质各小区域依序进入测量光栏内而被测量；也可用影象扫描，台物不动，测量光栏的象在台物上沿x方向和y方向来回移动，扫描测量重复性好，准确性和灵敏度高，测量精度可达10-9g，可方便地进行细胞内细微结构的分析，区分不同细胞类型的差别。
（二）显微荧光光度测量
定量显微荧光光度测量是组织化学和细胞化学中的另一种重要技术，可通过测试固定组织细胞内的荧光反应物来对生物学标本进行定量分析。荧光种类有物质的自发荧光或是用荧光染料对某些生物学物质作特选染色后产生的继光荧光。
与吸收光度测量相比，显微荧光光度测量有许多明显的优点。一般荧光测量所用染料浓度远比吸收法低，甚至可低10000倍，尤其在背景足够暗时可对低浓度荧光物质高度敏感，可测量细胞内分散的微小颗粒。荧光物质本身是自发光体，无论测量孔径内物体形状规则与否，物质分布均匀与否，物体辐射的光量子在光电倍增管上都产生同样的效应，所以无需扫描测量就可避免分布误差。通过选取适当的激发波长和发射波长的谱线和宽度，可以做到高特异性的测量，通常显微分光光度计选用适当的窄带滤色片来获取所需荧光波长，高精度的显微分光光度计采用光栅单色仪，可获得5nm带宽的激发波长和检测波长。荧光光度荧光测量方法分有堵塞法和扫描光度法，测量多数采用堵塞法，选取足够大的测量光栏对待测物作总体荧光量测定，样品由计算机定位，可快速测量，适于大样本分析。荧光光度测量缺点是：荧光易衰减，有漂白作用，有时会猝灭，还必须减去本底荧光值。因此测量时要提高信噪比，必须掌握适当的激发时间和合适的荧光标准。
三、图像分析系统
图像分析（image
analysis，IA）是分析细胞学中主要测量手段之一，常用于细胞形态分析、肿瘤细胞分析、染色体核型分析等方面，借助于显微分光光度技术，还可定量测试细胞内DNA，RNA含量和分布，随着图像分析处理技术的进展，图像分析处理的方法也由静态到动态，由平面到三维立体，由单色到真彩色而不断进展，它在生物医学应用领域中的作用将越来越重要。
图像分析处理通常是指计算机数字图像处理(image processing，IP)
，为了便于用计算机处理，必须把图像作为二进制数值来表示。普通光学系统和电视摄像等成像设备得到的是模拟图像，图像在二维平面上位置和强度的分布是连续的，要得到数字图像，必须对模拟图像进行空间点阵上的抽样和颜色灰度的量化的数字化操作，得到以像素为基本单位的数字矩阵，每个像素的颜色由灰度值表示，通常量化成8比特(bit)，即256个灰度等级。所谓数字图像就是灰度值的二维数组图像，如用函数F(x，y)表示数字图象，F(i，j)除了代表图像中位于i，j处的像素的同时，还表示该像素的灰度值的大小。数字图像一般采用正多边形点阵，最常用的是正方形点阵。图像数字化的精度对图像质量会有很大的影响，像素越多，图像分辨率越高，灰度等级越高，图像层次越丰富，清晰度高。数字图像运算建立在数字矩阵基础上，有许多基本处理功能和算法形式，与模拟图像比较具有精度高，通用性强，再现性和灵活性好等优点。
图像分析系统一般由计算机，图像输入设备，图像输出设备和交互控制设备构成。计算机系统，要求运算速度快，内存大，图像阵列处理器和显示卡的内存也应尽可能大，配备大容量存贮器便于图像备份。图像输入设备常用的有高解像度的摄像机、CCD摄像机、扫描仪和数码像机等。图像输出设备有视频打印机，激光打印机，图像硬拷贝机等。交互控制设备有鼠标和数字化图形输入板，可以用人机对话的方式选取工作菜单，执行指令，还可控制图形的输入和处理。
图像分析系统的核心部分是图像分析处理软件，分为通用软件和专用软件，它直接决定了分析结果的优劣。医学图像成像方式多种多样，来自不同途径的图像不可避免地存在着噪声和畸变，为了得到较好的图像分析处理结果，提取我们感兴趣的图像细节，首先必须进行图像增强(image
enhancement) ，在成像过程中
原图中总存在各种噪声和畸变，为使像质得到改善以利于特征提取和图像识别，对图像进行预处理，目的是图像增强也叫图像质量改善。图像增强的方法很多，对比度增强可通过灰度变换，直方图均衡等方式提高图像的对比度和清晰度。阴影校正和图像多帧数学运算可消除成像系统形成的照明场误差，改善图像的阴影，畸变和明暗差，突出感兴趣的图像特征。锐化处理通过微分法或梯度法等高频滤波算法可消除图像的模糊，增强图像高频成分，使图像轮廓分明。平滑处理常用局部平均法，中值滤波法有效地去除图像中高频噪声。
为了根据图像的结构特征，分离出感兴趣的对象物，以便进行图像识别和分析，图像分割(image
segmentation)是选取灰度阈值，区分主要对象、其他对象和背景的主要手段。图像分割通常用二值化阈值处理，根据图像的灰度直方图确定对象物的阈值，使对像物和背景以0和1分别显示，便于计算机处理，也可进行多相分割，通过灰度直方图中多个峰值加以区分，分别定出阈值，根据灰度阈值范围分割出各类对象物。
图像二值化处理(image binary)
通过各种矩阵算子对二值图进行腐蚀膨胀，开放封闭，填空洞，擦碎片，骨骼细化等形态学方法处理，也可采用布尔代数方法，进行逻辑运算，从而整理图像画面，清除不感兴趣的对象，便于计算机最终进行模式识别和特征提取，这种图像整理方法是图像处理不可缺少的步骤。
经图像分割和二值化处理后的图像，突出了对象物形态特征，最后进行图像识别(image
recognition)和图像分析，通过对图形特征的编码识别和描述，进行特征提取，然后进行全自动和交互测量分析。图像分析还可以作图像重建(image
reconstraction)和图像复原(image
restoration)。人眼只能感觉可见光，对可视图像进行判读和分析，对那些通过各种传感器观测的不可视信息的图像数字化是图像重建的一个重要内容，另外利用傅立叶变换等方法对X线断层扫描图像进行三维重建复原出体内器官的三维立体图形等，也是图像重建的重要内容。图像复原是利用各类滤波方式消除图像中噪声和模糊，改善图像质量。
