蛋白纯化经验指南-2
28) 首先我想问一下agarose和sepharose区别,我的理解是:都指琼脂糖,但agarose是未连接其他介质的,而sepharose是连接其他介质的,不知理解对不对?请指教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一种东西吗?
其次,我想问一下你纯化过GST融合蛋白没有?我现纯化一个融合蛋白(某种酶和GST融合),我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.分子克隆说直接将亲和介质于细菌裂解液混允离心....我不知我买的可不可以这样做.而产品说明书上说做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,装介质的柱子的高度和直径有要求吗?
agarose是通常的琼脂糖的英文名称，大家都这么叫，它不是商品的注册名称。而sepharose是amersham的琼脂糖凝胶的注册商品名称。所以你理解是有偏差的，此外agarose不一定是琼脂糖凝胶，而Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是同一类东西，只是厂家不同。
GST融合蛋白纯化过，5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用，也可以按照分子克隆的做法做，取决于你的喜好和方便。1ml不好装，除非有专门的小柱子，对于直径和高度没有特别的要求，我们的做法是：
1、 GST琼脂糖凝胶FF装柱，0.7X2.5cm，柱床体积为1ml；
2、 用缓冲液1平衡5个床体积，流速为1ml/min；
3、 将10ml发酵液用缓冲液1稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；
4、 用缓冲液1再洗10个床体积，流速为1ml/min；
5、 用缓冲液2洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰
6、 用纯水洗5个柱床体积，再用20%的乙醇洗5个柱床体积，流速为1ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存
缓冲液组成：
缓冲液1：20 mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。
缓冲液2：50mM Tris-盐酸缓冲液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M 盐酸29.2ml，307mg还原型谷胱甘肽，加水至1000ml。
29) 请问con A sepharose 4B 亲和凝胶使用前的处理方法？
不需要特别处理，直接平衡后就可以上样了。
30) 谢谢，我想问一下，是不是离子交换必须要线形梯度洗脱比较好呢？还是阶段洗脱好？检测器我想先收集然后再去测紫外。
也不是,有的时候阶段洗脱效果就很好,而且容易放大,不需要仪器,我比较喜欢,效果差不多,但是很省事.但是关键是容易重复.紫外分管测定那也可以,我上学也那样做过.
31) 我要从总蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western，由于量少所以要做免疫沉淀。我是利用小鼠来源的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、protein A－sepharose来做免疫沉淀，发现做完后跑电泳，出现了两条带，分别位于85KD、55KD左右，请问这会是什么东西？会是抗体吗？还有没有可能是目标蛋白变小了？
抱歉,我没有做过免疫沉淀,但是抗体做过一些,抗体重链没有大到85KD的地步,所以应该不是抗体.会不会你的蛋白有四个部分构成,分别是两个85KD和55KD,这样分子量正好和你的250KD相当,你可以跑非还原电泳看看,是不是还这样呢.如果不是,那说明是由这两个部分组成的.都是由二硫键连接的.
32) 我提胰蛋白酶，主要参考用张龙翔书里的办法，先提卵类粘蛋白，首先过SEPHADEX G-25 柱子脱盐，然后过DEAE纤维素离子交换柱；第二步是用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱。这些层析过程都可以在缓冲液里面加0.02%的叠氮化钠抑菌吗？以后怎样去除？
我提胰蛋白酶粗酶用的乙醇，可以用异丙醇或正丁醇或其它的低分子醇吗？浓度多大为好？
那实验我知道，你用什么方法活化琼脂糖呢，胰蛋酶的亲和纯化方法很多，配基有大豆胰蛋白酶抑制剂，抑肽酶，苯甲脒类，特别是后面的苯甲脒，可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶，何必自己去提取呢，感觉比较复杂，自己偶联这些配基也可以，层析过程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌，尽量不要加，那透析或者除盐柱子都可以，或者直接上一样的亲和柱子，用不含这个的缓冲液洗，最后洗脱下来就可以了。
最好还是用乙醇，浓度很难说，因为和你的蛋白浓度有关，别的醇用得很少。此外你可以考虑用硫酸铵沉淀，这样对活性更好些。纯化也可以用疏水，因为它在苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附，配合硫酸铵沉淀也是不错的选择。
33) 楼主,我想问一下phenyl-sepharose CL-4B有没有浓缩作用,以前有人做过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,可是,我却没有使纯化的蛋白浓缩,我想得到浓度较高的蛋白,又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱子的选择上有什么要求,使洗脱下来的蛋白浓度会较高,
亲和，疏水，离子交换都可以浓缩样品，但是离子交换是最便宜的，苯基可以浓缩，但是想有好的浓缩效果，最好用一次洗脱或者阶段洗脱的方法，我建议你先用离子交换柱子挂住，然后直接用高盐洗脱，因为不知道你蛋白的等电点，所以不知道你该选什么柱子。如果样品含盐高，那可以用疏水，然后直接用缓冲液洗脱就可以。亲和也差不多这样的。流速没有太大的要求，柱子看你手头有什么，离子交换是最常用的。上点样
34) 我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步使用氧化铝物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脱盐和浓缩,可是效果很差,基本是起不到浓缩的作用.
我做了好几次,都是这样,可是前面有人做的时候起到浓缩的作用,我现在却做不出来,也联系不上以前做过的人.
phenyl-sepharose CL-4B使疏水层析,我现在就这种柱子,我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的还是小的,洗脱蛋白时会使洗脱的蛋白峰值高一些,谢谢
这个酶纯化应该可以用亲和的方法做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以特异用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,但是除盐不好,你想浓缩效果好,你可以把硫酸铵的浓度提高到2.5M再挂在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的效果好,那尽量用短粗柱子,也就是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐浓度高点,这样保证能浓缩好你的样品.
35) 楼主：这段在用离子交换柱过抗体，请问抗体的吸收图谱是怎样的？它的特征吸收峰在哪里，不同的多克隆抗体是不是还有自己的特征吸收峰，
抱歉,你是说色谱图还是紫外吸收图呢,蛋白一般都是在280检测的呀,不同的的蛋白虽然有一点差别,但是那也不是很明显的,其实就用280就可以了.
36) 我的蛋白以GST融合蛋白的形式表达在E Coli中，分子量14~15kDa，蛋白的疏水性很强，等电点在7左右。菌破碎后，用表面活性剂提取的融合蛋白，据文献说是由于此蛋白和细胞膜结合，所以如果不加表面活性剂，上清中电泳检测不到。加表面活性剂后，提取效率还可以。上GST 胶。开始时采用先洗脱融合蛋白，再酶切，洗脱采用10mM GSH洗脱，没有加表面活性剂。然后酶切后，就会产生大量沉淀，上清中没有目的蛋白。后来在酶切buffer中也加表面活性剂，就得到了改善，没有再出现沉淀，目的蛋白也存在于上清中。目的蛋白中仅有一个cys。
我的问题是：
1、老板不知从那看了篇文献，是专门讲此蛋白的结构的。不过人家的蛋白是合成出来的，然后用反相C18（300A孔径）分离的。他非要我不上GST胶（因为binding 效率不是很高，GST价格很贵，工业化好像也没几家），提取液先酶切，沉淀后离心上反相分离。我觉得沉淀中的杂质组成不很清楚，如果有大一点的蛋白变性沉淀之类，用反相会不会很容易堵柱子？我看一些资料，反相只用来分离或分析短肽，较少用于分离较大的蛋白，尤其是我的杂质都不清楚的情况下。
2、过去曾做过superdex200 10/300分离酶切产物时，由于目的蛋白聚集，我也没有marker，每个峰较难定性，电泳看不出来，可能是浓度太低。我想用反相有没有可能建立一种便捷的分析方法来分析纯化过程中目的蛋白的量？
3、我的蛋白酶什么好的测活方法，只能做细胞毒性试验。有一篇文献说在生理条件下，我的蛋白没有二级结构，尽管在一定浓度下未沉淀，但是都以多聚体存在，如果加入50% TFE(三氟乙醇，trifluorethanol),则可使其在中性pH下恢复二级结构，此时大部分以二聚体存在。那么，你用过TFE防止聚集么？这样做有什么根据么？好象一般都只用表面活性剂（对细胞有毒性），或L-arg，PEG之类的，可我没找到在L-arg和PEG存在下，目的蛋白的结构功能方面的文献。现在不清楚多聚体是否就一定没有活性？郁闷阿，望多多指教！
4、我的GST结合效率不很高，总有部分流穿（应该没有超过载量），而放慢流速改观也不明显，后来结合的时候binding buffer中也加表面活性剂稍微好一点，但还是不满意。我曾试过把流穿收集再进GST柱，可是几乎不结合，所以我怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分。我曾看过一文章，提取时采用离子型表面活性剂，binding时在加入triton X-100，采用混合表面活性剂，据说可以使GST部分复性，增加binding，我还没有试过。
您有这方面的经验么？多谢了
1,其实反相价格会更好点,因为有机器,柱子和流动相也不便宜,其实我们用的是国产的GST融合蛋白的纯化系统,价格就不贵,你PM你的邮件给我,我给你一份材料,反相柱子其实做不了多少东西,所以建议你别用它制备.
2.只要你有标准蛋白,那用HPLC做分析代替电泳是很不错的,因为这样时间缩短了,效率更高,而且定量很准确.
3.三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
4.至于你柱子挂得少,那有可能是因为有些目标蛋白的结构和能挂上的不一样,那你可以试试降低上样的浓度,包括降低疏水性,加表面活性剂看看,这个不做怕是不知道的,因为只要GST没有活性或被屏蔽,那肯定挂不上.
37) 色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢？我现在知道有羧甲基纤维素，sp-sepharose等，但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了，450/25ml。你能推荐一下比较不错的介质吗？物美价廉的，谢谢！
维素不好操作,还是用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的材料.
38) 一是电泳后凝胶里面德蛋白质有什么可靠的方法回收？
二是我现在有个GST融合蛋白，用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱，请问可能是什么原因有什么办法解决
还真没有做过,你可以用电洗脱的方法,然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
