蛋白纯化经验指南-4
86) 选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
1,我们实验室没有sephadex G75(3000-80000)，最接近的就是sephadex G100(4000-160000)，而且都是80年代的产品，如何判断还能不能用？网上可以找到这两种填料的说明书吗?
2,您所说的处理量指的是样品的质量(mg)还是上样的体积(ml)?就我所知有两种计算方法。其一是根据质量算：蛋白质技术手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的质量(mg),柱的长度=柱直径*30，但这个柱直径 的计算公式我没看明白，用不上；其二是根据上样体积算：如果上样量是1ml，按1%的柱床体积则需要100ml树脂，直径1.5-1.6，长度50-60，但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂，这样柱参数的变化又极大。您通常是怎样计算的?(具体到我所要分离的蛋白上样量是1ml,包含杂蛋白的总质量是4mg)
3．100ml树脂和50ml树脂对样本的稀释度是不是2:1?
1.G100刚性不好,容易因为压力,盐变化而体积改变,实在没有办法也只能用这个,但是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才能保证有很好的分离效果,说明书我想不好找，但是它和所有的sephadex处理是一样的。
2，处理量对于凝胶过滤一般是按体积算，通常上样量是柱床体积的5%左右应该，如果很接近，也可以降低到2%，你的1ml样，1.6x60cm的足够了。
3。一般稀释至少在2以上。
87) 还有个小问题，是不是G后面的数字越大，就刚性越差，越容易受外因素影响？
是的,G后面的数字越大，就刚性越差，越不耐压和盐溶液。
88) 我表达的是带有GST的融合蛋白，醇化后需用凝血酶切割，我想问一下这个凝血酶与临床上用的凝血酶一样吗?
是一样的，但是用于酶切的要求的纯度更高。
89) 在做WB，因为是血清标本，含有较多的白蛋白，可能影响我的实验结果。我请问过ptglab楼主，他推荐我来这儿问一问。请问高手有什么方法吗？哪一种比较简单经济？蓝色琼脂糖凝胶可以分离吗？
用蓝色琼脂糖凝胶就可以去除，我觉得很快也很特异，样品直接穿过柱子白蛋白就可以去掉90%以上，你pM你的邮件地址给我，我给你一份相关的材料，我们这里就有这个填料。
90) 凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析上样时，对样品目的蛋白浓度的要求是不是一样的？样品浓度一般要求在多大范围内？
凝胶过滤处理样品量主要是受体积的影响大，浓度相对要小一些，上样量在床体积5%左右，如果是除盐可以上到20%左右。
其他的主要是上样的浓度，一般就在5-10mg/ml填料，具体的情况得看填料的载量和使用说明。
91) 我问的意思 是在纯化过程中，如果蛋白酶抑制剂去掉了，而该蛋白酶还未去掉，我担心此蛋白酶还会消化我的目的蛋白，请问我说得有没有道理？有没有必要考虑？
你可以用抗体做WB检测你的纯化的蛋白，如果确实有酶解的现象，那你可以在纯化过程中你的缓冲液里加一些抑制剂，然后再做对比，我觉得你考虑得很周到，这个也是值得注意的问题，但是纯化的过程时间不长，一般没有必要这么做，但是有的蛋白有降解的现象，那就加试试。
92) 离子交换层析、亲和层析上样时样品的蛋白浓度可以达到5-10mg/ml？我觉得浓度是不是太大？
抱歉，没有说清楚，我的意思是填料的载量大多在这个范围，所以上样的多少由填料对你的目标蛋白的载量有关，也和填料的性质有关，一般的上样量可以按5-10mg/ml填料的量来上，至于浓度高到5-10mg/ml的样品也没有什么关系，因为其中真正你的目标蛋白不一定很高，所以其实这样的浓度也没有关系，具体的量和浓度还是要经过实验才知道。
93) 破碎菌体,加pBS缓冲液,目标蛋白就可以容于pBS缓冲液了吗？我的蛋白是包涵体。
那你就得用8M的脲或6M的盐酸胍溶解包涵体，然后复性再纯化了，用普通的缓冲液是溶解不了你的目标蛋白的，你的蛋白再破碎后的沉淀里，不在上清中。
94) 你好，我最近做纯化，遇上了两个问题，第一是使用sephrose fast flow做初纯，因为胶不够，我就将一年前使用过的旧胶（放在冰箱里）加入在正在使用的胶里面，出现了怪现象，整个胶变成了絮状， 沉不实，我一看，旧胶里面是有很多絮状物（不是其它东西，也是胶）漂在上面，下面沉淀的是胶，我立即加入了2M的NaCL，这时分层了，絮状物在上面，下面是胶，我于是除去了上面的东西，把下面的胶加上水清洗了三次，又用pH5.0的NaAC
处理了三次，完了，又变回当初的絮状态了，象稳定的絮状胶体一样，真不知到底怎么回事（也就是说加盐它就能沉，加水就絮状胶体），我的胶是不是不能用了？
另外，我做亲和，目的蛋白下面有两条带怎么都去不掉，我的蛋白是4聚体，是不是做SDS－page将它 解离了？我打算做native看看，但是高效液相结果显示很纯的，只是主峰后面有个类似拖尾的小峰，不知道是不是没有分离开，想请你帮我指点一二，另外能不能介绍下亲和方面的资料，非常感谢
你的旧填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,如果不好,那就没有办法了,但是一般这么处理应该没有问题.
亲和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我觉得你得先说清楚这样才好分析.
95) chromatography兄,很感谢你的帮助,我这里没有抽滤漏斗,请问那里可以买?贵吗? 我明天用你说得办法处理几次,看看有没有办法解决,如果没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?
亲和我使用的是sephrose cl 6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,共同存在时才有活性,那两条杂蛋白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱采用底物类似物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉其中的一条杂蛋白,但是另外较小的那条基本很难去除,有杂蛋白存在时酶活往往降低的好快,请chromatography兄帮我分析分析原因,很感激.
这样的砂心漏斗试剂公司就有，不贵，一套也就300来元，没有抽滤还没有别的好代替了，也可以用中间夹膜的漏斗。
至于你说的两条带，那按理你用底物类似物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢，你平衡用什么条件，洗脱呢，你用什么活化的填料，我觉得非特异吸附的情况是存在的，你可以改变洗脱的方式，通常这些非特异吸附是离子交换作用，你可以可以在平衡液里增加点盐，这样可以去除这样的吸附，此外你目标蛋白会不会降解，这样有小分子还一样被吸附，你可以通过抗体做WB看看，如果是这样，那只能在纯化过程中加一些酶的抑制剂来避免。
我能想到的就是这两种情况了。
我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基，采用pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液平衡，洗脱是等PH条件下进行的，只不过改变了洗脱剂的浓度，从最大浓度洗脱的结果看，往往就少了其中一条带，你的解释我会认真思考的，亲和中存在离子吸附，是不是目标蛋白和杂蛋白的等电点很接近造成的？平衡液中加点盐，主要起什么作用？一般加多少？使用什么盐好那？如果是我的蛋白解离，这样的杂蛋白有没有什么别的方法洗掉（除了加酶的抑制剂）？
你其实还是没有说清楚你活化的方法，看你的意思好象是环氧活化的方法，不知道你是怎么偶联的，如果你觉得是秘密，那也没有关系，只是你不说我很难判断是不是有非特异吸附，总之要是氨基和羧基缩合的方法，难免有离子交换作用，溴化氰也是这样的，而如果是环氧活化的方法，那么就没有离子交换的非特异吸附，至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也足够了，如果是因为降解，那也许用这样亲和的方法就得把条件摸更细致点，如果不行，那可以看凝胶过滤能不能分开，即使不是降解，你也可以考虑凝胶过滤，而从你反映的情况好象杂质是个酶，加点抑制剂看看吧。
真的谢谢你无私帮助，我来到这个公司之前，他们就 已经使用这种方法了『硼氢化钠和氢氧化钠活化的，然后加入偶联剂过夜，最后加入配基』，我也不知道为什么，和经典的环氧等方法不一样，我们偶联剂用的是10个C，培基是带氨基的，硼氢化钠应该是还原剂的，基质是sepharose cl－6B，具体对这方面我不是很了解。我想最近作个native，和SDS对照一下，看看是不是降解，此外，这两条杂带从离子交换的时候它就一直存在的。
我就把胶放在柱子里，加上碱洗了三次，上面的水直接吸走，然后水洗，在加浓盐洗了两次，上面就漂浮着一层悬浮物，我小心再把它从上面吸走，之后在水里面好像就很好了，显微镜下我仔细看，与新胶没什么区别，谢谢你的帮助哦，我只是没有砂心漏斗，没法子试试而已。活化的方法是什么？我自己都不清楚.
96) 1、我们用CM52大量纯化某蛋白，经常会碰到介质裂缝，不知什么原因？
2、离子交换层析时柱高/直径的值有很高要求吗？如果为5/7会对分离有很大影响吗？用PB或ABS平衡时你们一般用多少柱床体积？
3、我们用5KD超滤浓缩后蛋白的损失很大，能否帮忙分析一下原因（PALL 的超滤器）？
那也许是因为有气泡,累积到一定地步后就穿过介质所以裂缝,你流速不能太快,而且缓冲液脱气,这样就应该好了.
2.一般离子交换没有必要算什么高/直径比，一般用的短粗柱子，亲和和疏水也都是这样的就可以，没有刻意要求，5/7应该影响也不大，当然如果你走线形梯度洗脱，也适当把这个比值增加点，如果走阶段洗脱就没有关系。
3。超滤膜本身的面积不小，这样也会吸附蛋白，特别是处理的量比较小的情况损失会很明显，如果量大，那损失会小的，此外如果蛋白不耐剪切力，那么用这样的方法浓缩也要特别小心，因为失活会很明显的。
97) 我做的是原核表达蛋白质，目的蛋白是一个GST-融合蛋白，现在通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了，正在做纯化，但是过柱纯化后发现还有其他的几条带，应该只有目的条带的，我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发现杂带还有几条，但目的条带却不见了，
1.为什么目的条带不见了？
2、下一步应该怎么办呢？
如果你的有一些别的杂带，那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积，此外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱，你试试，此外加大上样的流速，缩短作用时间，在你的平衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附，你的带不见了，可能是
triton-100干扰结合，所以不能用，你用吐温也试试看，因为这个纯化特异性是比较高的，除非你的蛋白有降解现象，你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的目标蛋白，总之修改的方案就是我说的这几个，摸索一下吧。
