实验室分析方法--高效色谱法的基本概念
一、基本概念和术语
1、色谱图和峰参数
色谱图（chromatogram）：样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）。
基线（base line）：经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
噪声（noise）：基线信号的波动。通常由电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
漂移（drift）：基线随时间的缓缓变化。主要由操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰（peak）：组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和拖尾峰（tailing peak）。前者少见。
拖尾因子（tailing factor，T）：用以衡量色谱峰的对称性，也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）。《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。
峰底：基线上峰的起点至终点的距离。
峰高（peak height，h）：峰的最高点至峰底的距离。
峰宽（peak width，W）：峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。
半峰宽（peak width at half-height，Wh/2）：峰高一半处的峰宽。Wh/2=2.355σ。
标准偏差（standard deviation，σ）：正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。
峰面积（peak area，A）：峰与峰底所包围的面积。A=2.507σh=1.064Wh/2h。
色谱图和峰参数见下图。
色谱图和峰参数
2、定性参数（保留值）
死时间（dead time，t0）：不保留组分的保留时间，即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相 HPLC 中可用苯磺酸钠来测定死时间。
死体积（dead volume，V0）：由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有 Vm 参与色谱平衡过程，其他3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0=Ft0（F为流速）。
保留时间（retention time，tR）：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
保留体积（retention volume，VR）：从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。
调整保留时间（adjusted retention time，t'R）：扣除死时间后的保留时间，也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只取决于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。
调整保留体积（adjusted retention volume，
）：扣除死体积后的保留体积。V'R=VR-V0或V'R=Ft'R。
3、柱效参数
理论塔板数（theoretical platenumber，N）：用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N 取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。N 与柱长成正比，柱越长，N 越大。用 N 表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1m时的理论塔板数（N一般在1000以上）。
4、相平衡参数
①分配系数（distribution coefficient，K）：在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K 有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。
在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定、样品浓度很低（Cs、Cm很小）时，K 只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K 减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度的增大，K 也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内的浓度降低，K 恒定时，才能获得正常峰。
在同一色谱条件下，样品中 K 值大的组分在固定相中的滞留时间长，后流出色谱柱；K 值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在 HPLC 中，固定相确定后，K 主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及 pH 值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，从而达到分离的目的。
②容量因子（capacity factor，k）：化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。容量因子也称质量分配系数。
容量因子与分配系数的不同点是：K 取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积 Vs、Vm 无关；k 除了与性质及温度有关外，还与 Vs、Vm 有关。由于 t'R、t0 较 Vs、Vm 易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。
③选择性因子（selectivity factor，α）：相邻两组分的分配系数或容量因子之比，又称为相对保留时间。要使两组分得到分离，必须使α≠1。α 与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α 的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。
5、分离参数
分离度（resolution，R）：相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值，也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。当R=1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R=1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5又称为完全分离，《中国药典》规定R应大于1.5。提高分离度有三种途径。
①增加塔板数：方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压；更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。
②增加选择性：当α=1时，R=0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：改变流动相的组成及 pH 值；改变柱温；改变固定相。
③改变容量因子：这通常是提高分离度最容易的方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k 趋于0时，R也趋于0；k增大，R也增大。但k不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k在1～10范围内，最好为2～5，窄径柱可更小些。
