放射免疫测定法检测抗生素残留
1、基本概念和原理
由 Berson 和 Yalow(1959)提出的应用同位素标记技术来检测抗原抗体的高灵敏度方法,称为放射免疫测定法。实际上,RIA 测定就是应用放射性物质代替 EILSA 中的标记酶作为抗体的偶联物,在食品安全快速检测中最常见的同位素是3H和14C。1978年 Charm 氏在 RIA 技术的基础上发展了放射免疫受体检测技术(RRA)。
RRA 在检测食品中抗生素残留的原理主要是基于以下两个方面,其一,每类抗生素族均是在一个母环基础上用不同功能团修饰形成特定功效的抗生素,例如:青霉素类是在内酰胺母环上加上不同功能团,形成了阿莫西林、氨苄青霉素、青霉素 G,其中青霉素 G 是最基本的青霉素。其二,微生物细胞表面都存在着能与各种抗生素功能基团结合的特异受点(这种高度的专一性类似于抗原和抗体间的专一性)。抗生素抑制细菌生长的能力是由微生物特定位上的附着决定的,并由此打断该细菌的代谢活动。结合反应是在标记的靶参考物(示踪物)与无标记的待测药物(非标记物)之间竞争进行的。测试建立在药物的功能团和微生物细胞专一性受点的结合反应的基础上。
| 抗生素 | 组织 | 鸡蛋 | 血液 | 饲料 | 谷物 | 蜂蜜 | 牛奶 |
| 青霉素 | 50 | 50 | 200 | 200 | 200 | 50 | 3.5 |
| 磺胺二甲嘧啶 | 100 | 50 | 400 | 250 | 250 | 10 | 10 |
| 磺胺二甲氧嘧啶 | 40 | 20 | 150 | 100 | 100 | 4 | 4 |
| 磺胺甲嘧啶 | 40 | 20 | 150 | 100 | 100 | 4 | 4 |
| 磺胺噻唑 | 80 | 40 | 300 | 200 | 200 | 8 | 8 |
| 磺胺嘧啶 | 40 | 20 | 150 | 100 | 100 | 4 | 4 |
| 四环素 | 20 | 20 | 40 | 100 | 100 | 4 | 4 |
| 金霉素 | 100 | 100 | 200 | 800 | 800 | 20 | 28 |
| 土霉素 | 100 | 100 | 200 | 800 | 800 | 20 | 19 |
在此方法中,将细胞上具有特异性受体点的细菌加到含有3H或14C标记药物的牛奶或组织提取物中,这些加放射标记的药物与样品中所含的药物残留物竞争可利用的细胞受体部位,样品经离心除去上清液,沉淀在β-闪烁液重新悬浮,用液体闪烁计数器来测量其放射性。样品的放射性与判定点(controlling point)比较,判定点的值是采用6个误差在±15%的平行加标样品的均值。样品的放射强度与样品中残留物的含量成反比。牛奶、血清、鸡蛋、组织中的检测限在低于10-6范围内,CharmⅡ检测现已发展到可检出内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类、氨基糖苷类和磺胺类这六大常见抗生素残留的快速检测。
2、应用举例——CharmⅡ测试
在现有的放射性检疫检测方法中作为快速检测方面最成功的例子是 CharmⅡ6600/7600抗生素快速检测系统,该检测系统就是利用专一性受体来识别结合同一类抗生素族中的母环以便以最快的速度同时检测同一抗生素族在样品中的残留情况。它可以检测动物和鱼类的肌肉组织、蛋类、饲料、蜂蜜、水、水果、蔬菜、谷物等样品。目前 CharmⅡ7600检测系统就 β-内酰胺类、氯霉素类、四环素类、磺胺类、邻氯青霉素及碱性磷酸酶这六项检测已被 FDA 认可。现以牛奶中 CharmⅡ β-内酰胺测试竞争性检测为例,对其工作原理、操作方法等方面详述如下。
①原理 CharmⅡ7600/6600型 β-内酰胺实验使用一种具有吸附所有 β-内酰胺药物的特殊受体的细菌,这种细菌随同一种被14C标记的特定量青霉素 G一起加入牛奶样品。牛奶样品中的任何一种内酰胺均会和这种特殊标记的青霉素 G 竞争性地与细菌细胞上的特异性受体结合。
把吸附于受体位点上的14C 青霉素 G 的数量和预先测定的控制点或标准曲线进行比较。14C-青霉素 G 的量越大,则样品中 β-内酰胺的浓度则越低(也即 cpm 数值越大,则样品中 β-内酰胺浓度越低)。Charm Ⅱ检测推荐的抗生素残留筛选水平见下表。
②操作步骤
a.把绿色药片(即细菌载体)加入空试管中。
b.加入300μL±100μL水。混合10s 至药片溶解,必要时可延长时间以确保药片的溶解。
c.加入5.00mL±0.25mL 样品或标准物(青霉素 G)。(注:每一个样本使用一个新试管吸头。牛奶温度0～7℃。)
d.加入黄色药片(被14C 标记的青霉素 G),在15s 内通过上下旋转牛奶15次使其立刻混合。(注:加药片及混合所有样本必须在40s 内完成。)
e.在85℃±2℃的恒温箱中保存3min。
f.离心3min,立刻从离心机中取出并倒掉牛奶。(注:如果必要,用棉拭擦去脂肪环,保持试管倒置。)
g.用棉拭擦去脂肪环并使其干燥。注意不用破坏药剂。
h.加入300μL±100μL水,彻底混合至药剂溶解(在添加闪烁液之前药片必须是浮在水中)。
i.加入3.0mL±0.5mL闪烁液,加盖,倒置(或摇动)直至混合物形成均匀的浑浊液。
j.在分析仪中进行60s 计数。在14C 频道读出每分钟计数。
③解释结果 基准点是介于阴性结果和阳性结果之间的一个截断数字。
如果样品每分钟计数是大于基准点,则样品为阴性。
如果样品每分钟计数是小于或等于基准点,则样品是“假设阳性”,应该再测试(见假设阳性检测)。
如果样品结果位于基准点以上不足50 cpm,则需重新计数这一测试管。如果每分钟计数是大于基准点,样品为“阴性”;如果每分钟计数是小于或等于基准点,则样品为“假设阳性”,那就必须再次测试(见假设阳性检测)。
④基准点(对照点) 基准点的测定是使用0.0080IU/mL(4.5μg/kg)青霉素 G 作阳性控制标准,以建立一套数据值判别阳性或阴性。对每一种新型试剂建立一套基准点和零点控制均数。
a.操作3次零点控制标准以确定均数。这作为零点控制均数。
b.操作6次阳性控制标准以确定均数。
c.在阳性均数上加15%则为基准点。如果所有6次测定都在阳性均数的15%以内,则基准点有效。对于单个偏差,则重做基准点测试。
⑤假设阳性试验 “假设阳性”样品的检测要备成双份以同时和一份阳性控制标准和一份零点控制标准配对用于阳性和阴性控制标准的试剂瓶必须和用于基准点测定的瓶子分开。
a.零点控制标准必须在零点控制均数±20%以内。
b.阳性控制标准必须小于基准点。
c.如果条件满足而且测样品的任何一个小于或等于基准点,则样品是“β-内酰胺筛选阳性试验”。如果需要,阳性样品可定量测定。
⑥操作监控 每天测试样品前测一个零点控制和一个阳性控制标准,以确定仪器和试剂的正常。
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