实验室分析方法--液相色谱分类及基础原理
液相色谱是一类分离与分析技术，其特点是以液体作为流动相，固定相可以有多种形式，如纸、薄板和填充床等。在色谱技术发展的过程中。为了区分各种方法，根据固定相的形式产生了各自的命名，如纸色谱、薄层色谱和柱液相色经典液相色谱的流动相是依靠重力缓慢地流过色谱柱，因此固定相的粒度不可能太小（100μm～150μm左右）。分离后的样品是被分级收集后再进行分析的，使得经典液相色谱不仅分离效率低、分析速度慢，而且操作也比较复杂。直到20世纪60年代。发展出粒度小于10μm的高效固定相，并使用了高压输液泵和自动记录的检测器，克服了经典液相色谱的缺点，发展成高效液相色谱，也称为高压液相色谱。
液相色谱按其分离机理，可分为四种类型。
一、吸附色谱法
吸附色谱法的固定相为吸附剂，色谱的分离过程是在吸附剂表面进行的，不进入固定相的内部。与气相色谱不同，流动相（即溶剂）分子也与吸附剂表面发生吸附作用。在吸附剂表面，样品分子与流动相分子进行吸附竞争，因此流动相的选择对分离效果有很大的影响，一般可采用梯度淋洗法来提高色谱分离效率。
在聚合物的分析中，吸附色谱一般用来分离添加剂，如偶氮染料、抗氧化剂、表面活性剂等，也可用于石油烃类的组成分析。
二、分配色谱法
这种色谱的流动相和固定相都是液体，样品分子在两个液相之间很快达到平衡分配，利用各组分在两相中分配系数的差异进行分离，类似于萃取过程。
一般常用的固定液有β,β'-氧二丙腈（ODPN）、聚乙二醇（PEG400～4000）、三甲撑乙二醇（TMG）和角鲨烷（SQ）。采用与气相色谱（GC）同样的方法，将固定液涂渍在多孔的载体表面，但在使用中固定液易流失。目前，应用较多的是键合固定相。在这种固体相中，固定液不是涂在载体表面，而是通过化学反应在纯硅胶颗粒表面键合上某种有机基团。
例如，利用氯代十八烷基硅烷与硅胶表面的羟基（-OH）之间的反应就可以形成一烷基化表面。这种固定液的优点是不易被流动相剥蚀。在分配色谱法中，流动相可为纯溶剂，也可以采用混合溶剂进行梯度淋洗，其极性应与固定液差别大一些，以避免两者之间相溶。通常可分为正相分配和反相分配。
三、离子交换色谱
离子交换色谱通常用离子交换树脂作为固定相。一般是样品离子与固定相离子进行可逆交换，由于各组分离子的交换能力不同，从而达到色谱的分离。
离子交换色谱法是新发展起来的一项现代分析技术，已广泛用于氨基酸、蛋白质的分析，也适合于某些无机离子（NO3-、SO42-、Cl-等无机阴离子和Na+、Ca2+、Mg2+、K+等无机阳离子）的分离和分析，具有十分重要的作用。
四、凝胶色谱法
目前，凝胶色谱法既适用于水溶液的体系，又适用于有机溶剂的体系。当所用的洗脱剂为水溶液时，称为凝胶过滤色谱，其在生物界的应用比较多；采用有机溶剂为洗脱剂时，称为凝胶渗透色谱，在高分子领域应用较多。
基本原理
使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛地应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。
什么是高效液相色谱法（HPLC）?
缩写 HPLC，引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大会上的文章，原指在填料柱中产生所需的流速需要高压(high-pressure) 这个事实。早期的泵只能承受500 psi （35bar）。这就被称为高压液相色谱法（HPLC）七十年代早期取得极大进步。新型的高压液相色谱仪器可以承受 6000psi（400 bar）的压力，还能配上改进的进样器，检测器和色谱柱。高压液相色谱法确实开始成为二十世纪七十年代中晚期的普遍分析方法。随着这一期间不断的性能改进（更小颗粒，更高压力），字母缩写保持一样，但全称变为高效（high-performance） 液相色谱（HPLC）。高效液相色谱（HPLC）是目前分析化学最强大的工具之一。它能够分离、定性和定量任何可以溶解在液体中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千万分之一也可。
一个储液瓶装有溶剂（称为流动相，因为溶剂是流动的）。一个高压泵（溶剂传输系统或称溶剂管理器）用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。一个进样器（样品管理器或自动进样器）可以将样品导入（注射）连续的流动相，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带（大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到）。流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。这种方法称为制备液相（在高效液相色谱量级中讨论）。注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。定性和定量样品内溶物浓度。由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。例如，如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器（ELSD）。最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测器可和质谱仪（MS）联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质联用。
