植物原位接种介导的小麦高效农杆菌转化方法实验（一）
试剂、试剂盒 缓释肥乙酰丁香酮
仪器、耗材 盆钵植物支撑器LB 培养基通用型试管YEP 固体培养基TSIM 培养基
实验步骤
一、材料
1. 母体植株的生长
( 1 ) 将母体植株种植于 12 , 7F ( 直径为 13 cm) 的盆钵中，每盆 4 株。
( 2 ) 用 Levingtons M2 培养土，并施用 5 g/L 奥绿专用缓释肥（15 : 9 : 9+ 3 MgO + TE；释放周期达 5~6 个月），并在介质表层铺一薄层蛭石。
( 3 ) 用 Teku 植物支撑器（LBS Horticulture Colne Lancashire, UK) 来支撑植株。
( 4 ) 托盘中铺上 Aquamat ( LBS Horticulture)，每盘放 6 罐（底部宽 30 cm、长 50 cm 的深砾石托盘）。
( 5 ) 由 Octamitters 控制浇水。
( 6 ) 所使用的生长箱是 Conviron PGV/PGW 36。
2. 小量甘油农杆菌制备法
需要准备以下材料：
( 1 ) LB 培养基（Sigma- Aldrich)
( 2 ) 通用型试管（25 mL，Sterilin)
( 3 ) 85 : 15 的 LB 培养基/甘油溶液（Sigma- Aldrich)
3. 农杆菌制备及接种
需要准备以下材料：
( 1 ) YEP 固体培养基：5 g/L 酵母提取物，10 g/L 蛋白胨，5 g/L NaCl，15 g/L 琼脂，pH 6.8（以上均购自 Sigma- Aldrich) 。
( 2 ) TSIM 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 100 mg/L 肌醇，10 g/L 蔗糖，500 mg/L MES 缓冲液（以上均购自 Sigma- Aldrich)，pH 5.2，过滤除菌。
( 3 ) 乙酰丁香酮（3 ,5 -diphenoxy- 4- hydroxyacetophenone) ( Sigma- Aldrich) ，0.1 mol/L 水溶液。
( 4 ) 25 μl 至 2.5 ml Hamilton 可重复使用的注射分液器（图 7.1)。
( 5 ) Hamilton 注射器（50 μl），带针头。
( 6 ) 量筒（500 ml)
( 7 ) 玻璃棒或类似的支持物
( 8 ) 透明塑料袋（455 mmx 600 mm)
( 9 ) Sanyo 多功能环境监测箱
4. 组织培养
需要用到以下材料：
( 1 ) Domestos 漂白剂（Lever Bros)
( 2 ) 乙醇溶液（70% V/V)：以去离子水配制
( 3 ) 无菌去离子水
( 4 ) 带 15 号刀片的手术刀（Swann-Morton，Sheffield，UK)
( 5 ) W4 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) ，2 mg/L 2，4-D，钠盐（Sigma- Aldrich) ，500 mg/L 谷氨酰胺（Sigma-Aldrich) , 100 mg/L 酪蛋白水解物（Sigma-Aldrich) ，6 g/L 1-A 型琼脂糖（Sigma-Aldrich) ，150 mg/L 特美汀 ( ticarcillin disodium/potassium clavulanate) ( Melford Laborato ries Ipswich, UK)，pH 5.8 。表 7.1 列出了培养基添加剂的制备细节。
( 6 ) W425G 培养基：其余同 W4 培养基，额外加入 25 mg/L G418，重硫酸盐 ( Sigma-Aldrich )。
( 7 ) MRM 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（MP Biomedicals) , 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA, Germany) ，6 g/L 1-A 型琼脂糖（Sigma- Aldrich)，2 mg/L 激动素 ( SigmaAldrich)， pH 5.8 。
( 8 ) MRM25G 培养基：其余同 MRM 培养基，额外加入 25 mg/L G418，重硫酸盐 ( Sigma- Aldrich) 。
( 9 ) Beatson 广口瓶（250 ml，Richardsons, Leicester, UK) 以有盖培养皿的底作为盖子，并以 25 mm 3M Micropore 的胶带封口。
( 10 ) MS20 培养基：4.4 g/L MS 盐和维生素（同前）， 20 g/L 蔗糖（Merck KGaA，Germany) , 7 g/L 经植物细胞培养测试过的琼脂（Sigma- Aldrich)，pH 5.8 。
( 11 ) Sanyo 多功能环境监测箱。
