PCR（聚合酶链式反应）的反应方法介绍--基本的PCR方法
由于各种PCR反应条件(如PCR扩增次数、温度、Taq DNA聚合酶的浓度、引物、氯化镁以及模板DNA)变异极大,应根据具体情况,对各种PCR反应条件进行相应调整。
按以下次序,将各成分加入0.2 ml灭菌扩增管中:
成分 体积 终浓度
10 × PCR缓冲液 5 µl 1 ×
10 mM dNTP溶液(pH 8.0) 1 µl 每种0.2 mM
10 µM 上游引物 2.5 µl 0.5 µM
10 µM 下游引物 2.5 µl 0.5 µM
5单位/µl 耐热DNA聚合酶 0.5 µl 2.5单位
DNA模板 1-10 µl 1 pg-1µg
消毒的蒸馏水 至50 µl
1.对于多管反应可配制混合液于一管中,然后分装至各管,以减少试剂损失和各管分别加样的不准确性。
2.将小管中的混合物混匀,并加入50 µl矿物油或硅化油覆盖小管中的混合物。
3.盖紧小管,短暂离心,以使PCR混合物沉于管底。
4.小管在温度循环器(PCR仪)中94ºC温育3分钟,以使模板DNA完全变性。
5. 按以下方法进行25-35个循环的PCR扩增:
变性 94ºC 30秒
退火 55ºC 30秒
延伸 72ºC 1分钟/1 kb
6.72ºC温育PCR样本10分钟,可于4ºC维持。样本可贮存于-20ºC直至使用。
7.采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物,溴化乙锭染色显影DNA,用合适分子量标准的DNA作参照。
