多色荧光原位杂交实验

2019.3.25

M-FISH 被成功地用于鉴别先天性疾病中的标记染色体或衍生染色体。近来该方法越来越多地被用于确认复杂核型中的多重染色体异常；在进行血液疾病的诊断时，M-FISH 在检测临界染色体重排中非常有用

试剂、试剂盒	DAPI 复染液乙醇 SSC 盐酸 HCl NP-40 胰酶 NaCl 柠檬酸钠 Spectra Vysion探针 M-FISH 探针
实验步骤	一、染色体标本制备 1.标本制备：不同标本来源的样品（血液、羊水、成纤维细胞培养物或骨髓）用其相应的标准程序进行制备。 2.用相差显微镜找到合适的中期染色体分裂相，将杂交区域标记出来。 3.将标本立在 37°C 装有 40 mL 胰酶工作液的染色缸中作用 2 min。 4.在一个 HYBrite(Vysis) 装置中人工老化片子，90°C、2 min。 5.在 HYBrite(Vysis) 装置中用 2XSSC 冲洗片子 2 min。 6.将标本在分别盛有 40 mL70%、85% 和 100% 乙醇系列的染色缸中室温下依次脱水 lmin，风干。二、杂交和洗脱 1.将 M-FISH 探针混合液（Vysis) 加到标记的杂交区域上。 2.将每张标本的杂交区域上覆以盖片，用橡皮泥在盖片周围封片。 3.将标本固定在加湿的 HYBrite(Vysis) 装置中，设置为：变性温度 80°C，时间为 3 min，杂交温度 37°C，杂交时间最少 16 h。 4.将标本在盛有 40 mL0.4XSSC 染色缸中 70°C 条件下洗片 1?2 min，用流动的去离子水洗片 2s。 5.将标本移入盛有 40 mL2XSSC/0.1%NP-40 溶液的染色缸中，室温下作用 IOs06. 每个杂交区域上加 10% 的 DAPI 复染液后盖上盖片，注意不要封片。收起
注意事项	1.不论新鲜制备的标本还是标本显带后相继M-FISH，将M-FISH的探针(Vysis，DownerGrove，IL)加到杂交区域上，盖上盖玻片并用橡皮泥封片，然后将玻片放入湿的Hybrite中，其设置如下：解链温度80℃、3min，杂交温度37℃，至少16h。通常新鲜制备的标本M-FISH杂交结果较好，因为G带通常要进行人工老化。 2.进行M-FISH分析时需要考虑的很重要的一点是：靶位点杂交和非特异结合的对比度。如果对比度较差，染色体分类颜色也将会不显著，对比度对远红外荧光尤其重要。加长胰酶处理时间有助于提高对比度，而处理时间过长将会导致染色体DNA和信号丢失，从而使染色体颜色暗淡。杂交盒湿度不够将会使杂交试剂脱水浓缩，这将会导致探针和染色体DNA随机杂交（松散结合），丛而使对比度下降。 3.获得理想结果的另一个重要因素是染色体形态。染色体形态不好将使DAPI带型转化为灰度时很难解释，也可导致染色体颜色从一条染色体流入另一条染色体。导致染色体形态不好的最常见原因是老化不充分，人工老化或将片子用热的2XSSC处理2min有助于改善染色体形态。通常用去离子水室温下冲洗标本继以DAPI复染也可以改善带型，但会降低杂交强度。增加老化或加长2XSSC预处理时间也会减少杂交强度。染色体形态不好也可能由过度变性引起。染色体形态很好但杂交效果很差通常提示标本过度老化、过久的2XSSC处理或变性不足。制备的标本较脏，玻片上留有较多的背景残片也会使结果受到不好的影响。明亮的荧光残片将使曝光时间缩短，影响染色体分类，用德克萨斯红时这种现象尤为明显。在人工操作模式下，加长标本的德克萨斯红平面曝光时间可使这个问题得以解决。 4.有时即使经过最大的努力，试剂或程序完全正确还是很难得到最理想的结果。这时就需要分别观察每个光平面，将之与制造商提供的表对比。例如，22号染色体（浅绿、红、绿）有时会被错划为3号（浅绿）染色体，可以分别观察红、绿光平面来确定这两种光谱是否存在，从而确定所观察染色体是不是22号染色体。 5.在染色体间相互易位和染色体重叠中，由于荧光素相互重叠，断裂和融合的交界处进行染色体区分时常常提示有第三条染色体或该区域变成灰色（图50。当易位片段很小时上述情况就很重要，根据观察到的颜色分类，将所有可能的染色体都考虑进来。例如，一个衍生的7号染色体从12号染色体上易位来一个片段，可能会被划为19号染色质（图5D)，因为7号染色体的标记为远红外（farred)，12号为金黄色和绿色（goldandgreen)，因此三种颜色组合（远红外、金黄色和绿色）正好是19号染色体的特征。因此要解决这个问题，我们必须用12号染色体wcp探针对样品进行分析，结果阳性可断定易位片段来源为12号染色体，结果阴性则可断定片段来源为19号染色体。当荧光组合超出分类系统的范围也会显示为灰色区域，例如，20号（远红外、浅绿色和红色）和21(金黄色和浅绿色）号染色体重叠结果产生一个4种颜色的组合（远红外、浅绿色、红色和金黄色），就会出现一个灰色区域，因为没有哪条染色体的颜色组合多于3种。 6.当衍生染色体的荧光光谱包含易位染色体的所有荧光素特征时，小的易位，特别是插人尤其容易被错读。举个例子，当1号染色体（金黄色）的小片段易位至5号染色体（金黄色和远红外），整条染色体看起来还像是5号染色体，单独使用1号染色体涂染探针就可以解决此问题。 7.组成性异染色质，包括富含a卫星的片段和富含重复DNA序列的近端着丝粒短臂，可以用未标记的Cot1-DNA封闭掉或探针中不包含其互补序列。这些区域也变成灰色或随机施以假色并进行分类（图5C)，在分析标记染色体或衍生染色体时必须谨记此现象。M-FISH的其他一些局限包括：不能检测大多数的染色体内异常（如倒位）和不大于3Mb的染色体间异常。

试剂、试剂盒

DAPI 复染液乙醇 SSC 盐酸 HCl NP-40 胰酶 NaCl 柠檬酸钠 Spectra Vysion探针 M-FISH 探针

实验步骤

一、染色体标本制备

1.标本制备：不同标本来源的样品（血液、羊水、成纤维细胞培养物或骨髓）用其相应的标准程序进行制备。

2.用相差显微镜找到合适的中期染色体分裂相，将杂交区域标记出来。

3.将标本立在 37°C 装有 40 mL 胰酶工作液的染色缸中作用 2 min。

4.在一个 HYBrite(Vysis) 装置中人工老化片子，90°C、2 min。

5.在 HYBrite(Vysis) 装置中用 2XSSC 冲洗片子 2 min。

6.将标本在分别盛有 40 mL70%、85% 和 100% 乙醇系列的染色缸中室温下依次脱水 lmin，风干。

二、杂交和洗脱

1.将 M-FISH 探针混合液（Vysis) 加到标记的杂交区域上。

2.将每张标本的杂交区域上覆以盖片，用橡皮泥在盖片周围封片。

3.将标本固定在加湿的 HYBrite(Vysis) 装置中，设置为：变性温度 80°C，时间为 3 min，杂交温度 37°C，杂交时间最少 16 h。

4.将标本在盛有 40 mL0.4XSSC 染色缸中 70°C 条件下洗片 1?2 min，用流动的去离子水洗片 2s。

5.将标本移入盛有 40 mL2XSSC/0.1%NP-40 溶液的染色缸中，室温下作用 IOs06. 每个杂交区域上加 10% 的 DAPI 复染液后盖上盖片，注意不要封片。

收起

注意事项

1.不论新鲜制备的标本还是标本显带后相继M-FISH，将M-FISH的探针(Vysis，DownerGrove，IL)加到杂交区域上，盖上盖玻片并用橡皮泥封片，然后将玻片放入湿的Hybrite中，其设置如下：解链温度80℃、3min，杂交温度37℃，至少16h。通常新鲜制备的标本M-FISH杂交结果较好，因为G带通常要进行人工老化。

2.进行M-FISH分析时需要考虑的很重要的一点是：靶位点杂交和非特异结合的对比度。如果对比度较差，染色体分类颜色也将会不显著，对比度对远红外荧光尤其重要。加长胰酶处理时间有助于提高对比度，而处理时间过长将会导致染色体DNA和信号丢失，从而使染色体颜色暗淡。杂交盒湿度不够将会使杂交试剂脱水浓缩，这将会导致探针和染色体DNA随机杂交（松散结合），丛而使对比度下降。

3.获得理想结果的另一个重要因素是染色体形态。染色体形态不好将使DAPI带型转化为灰度时很难解释，也可导致染色体颜色从一条染色体流入另一条染色体。导致染色体形态不好的最常见原因是老化不充分，人工老化或将片子用热的2XSSC处理2min有助于改善染色体形态。通常用去离子水室温下冲洗标本继以DAPI复染也可以改善带型，但会降低杂交强度。增加老化或加长2XSSC预处理时间也会减少杂交强度。染色体形态不好也可能由过度变性引起。染色体形态很好但杂交效果很差通常提示标本过度老化、过久的2XSSC处理或变性不足。制备的标本较脏，玻片上留有较多的背景残片也会使结果受到不好的影响。明亮的荧光残片将使曝光时间缩短，影响染色体分类，用德克萨斯红时这种现象尤为明显。在人工操作模式下，加长标本的德克萨斯红平面曝光时间可使这个问题得以解决。

4.有时即使经过最大的努力，试剂或程序完全正确还是很难得到最理想的结果。这时就需要分别观察每个光平面，将之与制造商提供的表对比。例如，22号染色体（浅绿、红、绿）有时会被错划为3号（浅绿）染色体，可以分别观察红、绿光平面来确定这两种光谱是否存在，从而确定所观察染色体是不是22号染色体。

5.在染色体间相互易位和染色体重叠中，由于荧光素相互重叠，断裂和融合的交界处进行染色体区分时常常提示有第三条染色体或该区域变成灰色（图50。当易位片段很小时上述情况就很重要，根据观察到的颜色分类，将所有可能的染色体都考虑进来。例如，一个衍生的7号染色体从12号染色体上易位来一个片段，可能会被划为19号染色质（图5D)，因为7号染色体的标记为远红外（farred)，12号为金黄色和绿色（goldandgreen)，因此三种颜色组合（远红外、金黄色和绿色）正好是19号染色体的特征。因此要解决这个问题，我们必须用12号染色体wcp探针对样品进行分析，结果阳性可断定易位片段来源为12号染色体，结果阴性则可断定片段来源为19号染色体。当荧光组合超出分类系统的范围也会显示为灰色区域，例如，20号（远红外、浅绿色和红色）和21(金黄色和浅绿色）号染色体重叠结果产生一个4种颜色的组合（远红外、浅绿色、红色和金黄色），就会出现一个灰色区域，因为没有哪条染色体的颜色组合多于3种。

6.当衍生染色体的荧光光谱包含易位染色体的所有荧光素特征时，小的易位，特别是插人尤其容易被错读。举个例子，当1号染色体（金黄色）的小片段易位至5号染色体（金黄色和远红外），整条染色体看起来还像是5号染色体，单独使用1号染色体涂染探针就可以解决此问题。

7.组成性异染色质，包括富含a卫星的片段和富含重复DNA序列的近端着丝粒短臂，可以用未标记的Cot1-DNA封闭掉或探针中不包含其互补序列。这些区域也变成灰色或随机施以假色并进行分类（图5C)，在分析标记染色体或衍生染色体时必须谨记此现象。M-FISH的其他一些局限包括：不能检测大多数的染色体内异常（如倒位）和不大于3Mb的染色体间异常。