间接原位PCR（原位杂交PCR）
间接原位PCR（原位杂交PCR）
| 实验材料 | 组织或细胞样品 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | SSC 硫酸葡聚糖 甲酰胺 脱脂奶粉 Denhardt’s 液 SDS 变性的鲑鱼精DNA Rnase DTT 乙醇 |
| 仪器、耗材 | 玻片 石蜡膜 橡皮泥 湿盒 |
| 实验步骤 |
一、预杂交 1. 试剂与配制 2×SSC 50%去离子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v） 预杂交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脱脂奶粉 2. 操作方法 （1）在进行完原位PCR扩增后，用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片，并简洗15 min； （2） 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15 min； （3）加预杂交液20 μl/片，在杂交温度下孵育30 min～2 h。 二、杂交 1. 试剂与配制 杂交液：50%去离子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10 mg/ml变性的鲑鱼精DNA 2. 操作方法 （1）弃预杂交液，加杂交液（含0.2～5 μg/ml探针）10～20 μl/片，覆盖经硅化的盖玻片，石蜡膜封片或橡皮泥封片； （2）玻片置于湿盒中，42℃杂交12～18 h（过夜，但不能超过24 h）。
三、杂交后处理 1. 试剂与配制 2×SSC Rnase（20 μg/ml） 50%去离子甲酰胺 10 mmol/L DTT 2. 操作方法 1. 杂交完毕，用2×SSC浸泡玻片数分钟，轻轻移去盖玻片，再用2×SSC洗玻片1～2 min； 2. 2×SSC（含20μg/ml RNase，适宜RNA探针，DNA探针可省略此步）中洗片30 min，37℃； 3. 2×SSC/50%去离子甲酰胺，42℃×10 min； 4. 1×SSC/50%去离子甲酰胺，37℃×30 min，2次； 5. 4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h； 6. 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30 min； 7. PBS中洗10 min，即可进行显色，方法同上。
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| 注意事项 |
1. 如果检测mRNA，双链探针应变性处理，方法是95～100℃加热10 min后迅速置于冰中骤冷； 2. 以单链探针检测DNA时，DNA也需变性处理，将玻片置于70～80℃变性液（70%去离子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10 min； 3. 用双链探针检测DNA时，可按上述方法变性处理。
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