分子生物学常用实验技术（七）
（四） 电泳分析
通常合成的cDNA 第一链和第二链长度为350-6000 碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12 步，一般第一链和第二链上样量相同。
1. 标准分子量DNA 参照物的同位素标记
(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA 聚合酶进行32 P 标记
10×HindⅢ缓冲液2.5μl
dATP 0.2mmol/L
dGTP 0.2mmol/L
[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg
Klenow DNA 聚合酶1μ
加H2O 到总体积25μl
(2) 室温放置10 分钟, 加2.5μl 200mM EDTA 终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。
2. 电泳分析
(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA 制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30 分钟。
(2) 取样品液, 用TE 调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉兰）。
(3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3 处，电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/LEDTA。
(4) 将胶浸入7% TCA 中,室温放置30 分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。
(5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X 光片(用增感屏时-70℃压片)。
二、其它cDNA 合成技术
除Riboclone
M-MLV(H-)cDNA 合成技术外，Promega 公司还提供有多个AMV
合成试剂盒，不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15
引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等，其余试剂一样，这些系统包括：
20mg 引物
20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下：
250mmol/L Tris?Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L
MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;
20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。
50ml 40mM 焦碳酸钠
625m rRNasin RNA 酶抑制剂
600m AMV 反转录酶
5mg 1.2kb 对照RNA
200ml 10×第二链缓冲液，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L
MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
2m E.Coli RNaseH
500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ
100m T4 DNA PolymeraseⅠ
1.5ml 不含核酸酶的水
以上所有试剂除对照RNA 需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。
（一）第一链合成
下面介绍的是25ml
体积反应系统，该系统可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反应体积10ml，如5mg mRNA 需55ml
反应体积。引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA 的比例应分别保持为0.5mg/mg（对NotⅠ引物-延接头
为0.3mg/mg）和15m/mg.
1、试剂：
[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM 和200mM)，TE 饱和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE 缓冲液(10mM Tris?Cl,pH8.0,1mm EDTA)。
2、操作步骤：
（1）取一灭菌的无RNA
酶的eppendorf 管加入的RNA 样品，及引物或引物-延接头，用H2O 调节0.5mg 引物/mg mRNA（或0.3mg
NotⅠ引物-延接头/mg mRNA）的体积至15ml，70℃加热5 分钟，待冷至室温，离心数秒钟使溶液集中在管底，然后依次加入：
5×第一链缓冲液5mlrRNasinR RNA 酶抑制剂25ml
40mM 焦碳酸钠2.5ml
AMV 反转录酶15m/mg RNA
加无水RNA 酶水至总体积25ml
在加入焦碳酸钠和AMV 反转录酶前，需将反应液42℃温浴5 分钟，以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。
（2）轻弹eppendorf 管，取出5ml 至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其体积不能超过1ml），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
（3）42℃温浴1 小时。
（4）取出置冰上。
（5）掺入测定的eppendorf 管加入50mM EDTA，终止反应，并使总体积为100ml。可取90ml进行电泳分析，另10ml 进行同位素掺入测定。
（6）第一链合成离心管可直接用于第二链合成
（二）第二链合成
第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。
1、第一链反应液（20ml）中依次加入
10X 第二链缓冲液10ml
E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m
E.Coli RNaseH 0.8m
加无核酸酶水至总体积100ml
余下步骤同本章第四节一（二）2-12 步及（三）和（四）。
思考题:
1. 为什么mRNA 提取是cDNA 合成成败的关键？
2. 试比较自导引导法和置换合成法合成cDNA 的优缺点。
