分子生物学常用实验技术（十）
第二节RFLP 技术
一、材料
基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。
二、设备
电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4 块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf 管(0.5ml)若干。
三、试剂：
1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
2、5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。
3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris?Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方见第九章。
6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris?Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl 。
四. 操作步骤
1. 基因组DNA 的酶解
(1) 大片断DNA 的提取详见基因组DNA 提取实验,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 没有降解。
(2) 在50μl 反应体系中,进行酶切反应:
5μg 基因组DNA
5μl 10×酶切缓冲液
20 单位（U）限制酶(任意一种)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。
(4) 取5μl 反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb 的明显亮带出现。
[注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。
2. Southern 转移
（1） 酶解的DNA 经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V 过夜)后EB 染色观察。
（2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl 中脱嘌呤, 10 分钟。
（3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45 分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30 分钟。
（4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC 中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC 盐溶液吸印,维持18-24 小时。也可用电转移或真空转移。
（5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30 秒, 迅速转至0.2mol/L Tris?Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。
（6） 将膜夹于2 层滤纸内, 80℃真空干燥2 小时。
（7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂?
第七章RFLP 和RAPD 技术
第一节概述
DNA
分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment
LengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP
是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA
水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA
的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA
后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。运用随机引物扩增寻找多态性DNA
片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplifiedpolymorphic DNA
，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD 技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA
多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR
技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10 聚体)为引物,对所研究基因组DNA 进行PCR
扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA
多态性。RAPD 所用的一系列引物DNA 序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA
序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR
扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA
片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR
产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR 产物检测即可检出基因组DNA
的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD
可以对整个基因组DNA 进行多态性检测。另外，RAPD 片段克隆后可作为RFLP 的分子标记进行作图分析。
本实验将学习RFLP 的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD 技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。
第二节RFLP 技术
一、材料
基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。
二、设备
电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4 块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf 管(0.5ml)若干。
三、试剂：
1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
2、5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。
3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris?Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方见第九章。
6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris?Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl 。
四. 操作步骤
1. 基因组DNA 的酶解
(1) 大片断DNA 的提取详见基因组DNA 提取实验,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 没有降解。
(2) 在50μl 反应体系中,进行酶切反应:
5μg 基因组DNA
5μl 10×酶切缓冲液
20 单位（U）限制酶(任意一种)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。
(4) 取5μl 反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb 的明显亮带出现。
[注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。
2. Southern 转移
（1） 酶解的DNA 经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V 过夜)后EB 染色观察。
（2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl 中脱嘌呤, 10 分钟。
（3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45 分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30 分钟。
（4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC 中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC 盐溶液吸印,维持18-24 小时。也可用电转移或真空转移。
（5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30 秒, 迅速转至0.2mol/L Tris?Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。
（6） 将膜夹于2 层滤纸内, 80℃真空干燥2 小时。
（7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。
[注意] 1、步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。
2、除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。
3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。
4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP 的差异，这时应该试用另一种酶。
第三节RAPD 技术
一、材料
不同来源的DNA(50ng/ul)。
二、设备
PCR 仪，PCR 管或硅化的0.5ml eppendorf 管，电泳装置。
三、试剂
1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。
2、Taq 酶：购买成品。
3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。
4、MgCl2 ：25mmol/L。
5、dNTP：每种2.5mmol/L。
四、操作步骤：
1. 在25ul 反应体系中,加入
模板DNA 1ul (50ng)
随机引物1ul (约5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq 酶1 单位（U）
加ddH2O 至25ul
混匀稍离心, 加一滴矿物油。
2. 在加热至90℃以上的PCR 仪中预变性94℃ 2 分钟, 然后循环: 94℃ 1 分钟， 36℃ 1 分钟，72℃ 1 分钟，共40 轮循环。
3. 循环结束后, 72℃ 10 分钟，4℃保存。
4. 取PCR 产物15ul 加3ul 上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。
5. 电泳结束，观察、拍照。
[注意] 1、电泳时一般RAPD 带有5-15 条, 大小0.1-2.0kb。
2、特异性的DNA 带可以克隆作为一个新的分子标记应用。
思考题
1. DNA 酶切反应不彻底会有何结果? DNA 发生降解有何影响？
2. Southern 转移中脱嘌呤时间为何不能太长？
3. 随机引物扩增,为什么会产生DNA 双链产物?
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
