云序客户再发高分文章，教你如何玩转tRNA机制研究
文章导读：
“忽如一夜春风来，千树万树梨花开！”自然界的花花草草在悄无声息的感受着大自然的变化。随着全球气候的变化，环境温度也在不断的变化，那么什么是温度感受器？AET1是tRNA上鸟苷转移酶，它是水稻高温条件下正常生长所必需的。本文研究结果表明，tRNAHis鸟苷转移酶AET1在植物应对高温环境中发挥着重要作用。
发表期刊：MOLECULAR PLANT
影响因子：10.12
实验方法：tRNA测序、RIP、RIP qPCR、RNA pull down
文章内容：
1. AET1突变水稻热敏性
AET1突变水稻在高温环境下生长时主要呈矮小株，叶片狭窄卷曲，无法产生种子，相反在相对温和环境下生长时没有展现其他异常性状。AET1基因的ORF区第1144个SNP（C突变为T）会引起第382个氨基酸从脯氨酸改变为丝氨酸。预测AET1基因编码tRNA鸟苷转移酶，多物种比对结果显示AET1基因在包含哺乳动物在内的多种真核生物当中都是高度保守的，而第382个氨基酸在大部分双子叶和单子叶植物中也是高度保守的。遗传互补分析（genetic complementation test）显示互补品系以及过表达水稻株都能够有效的逆转高温下AET1突变所造成的异常形状。CRISPR/Cas9的基因编辑水稻株也可以造成明显的生长缺陷。控制变量实验表明温度是造成这一现象的环境因素，并且AET1基因是水稻对非生物因素敏感的主要原因。进一步观察可以看到的是，尽管野生型和AET1突变水稻幼苗们没有明显的形态学改变，但是超微结构已经有巨大的改变，表明AET1基因对于高温条件下细胞的增值是必不可少的。所有的形态学观察和表型实验都说明AET1在水稻的生长、发育过程中对高温的应答过程种起到重要作用。
图1. AET1突变体是热敏性的
2.AET1对tRNAHis成熟和tRNA表达稳态起重要作用
体外酶活实验证明AET1编码的AET1His可以结合到pre-tRNA（tRNAHis前体）并在pre-tRNAHis 5’端添加鸟嘌呤，然而发生了突变的AET1P382S没有该功能，表明被突变的382位的脯氨酸对于tRNA的鸟嘌呤转移酶活性是必不可少的。tRNA测序（云序生物提供）结果表明，野生型和AET1突变型水稻株在正常和高温条件下成熟tRNA的表达水平改变。测序结果表明，正常温度下AET1突变体和野生型当中的tRNA异形体（isotype）含量相差不大，但是在高温条件下AET1突变体当中的含量要明显的高于野生型水稻株，并且高温条件下头部5’带有鸟嘌呤的tRNA在AET1突变体当中有明显的下降，这些现象都说明常温下，AET1基因的酶活性在AET1突变体当中没有太大改变，但高温下酶功能会明显丧失。tRNA测序分析可以看到其他类型的tRNA，比如tRNAMet，在AET1突变株当中的tRNAMet有明显减少，由于tRNAMet和蛋白的翻译效率相关，所以推测在高温条件下AET1敲除水稻株的发育缺陷很有可能是因为蛋白翻译效率低下造成。AET1基因对于tRNA丰度的维持必不可少，AET1的突变足以改变tRNA表达谱，在高温环境下，AET1介导的tRNA修饰可以改变多个和蛋白翻译效率相关的tRNA的表达水平。
图2. AET1突变在体外消除了AET1的活性，并破坏了体内tRNA表达谱
3.AET1、RACK1A、eIF3h在内质网上的相互作用
酵母双杂交实验说明两个和核糖体相关的蛋白RACK1A以及eIF3h都和AET1相互作用。RNA pull down（云序生物可提供）也证明了AET1与RACK1A以及eIF3h结合。通过GST标签的RACK1A蛋白也能够富集MBP融合eIF3H。这些结果都能够进一步证明AET1、RACK1A以及eIF3h三个蛋白能相互结合。生物分子荧光互补实验证明RACK1A、eIF3h以及AET1三者能持续相互作用，这些结果都证明三个蛋白在体内能直接相互作用。融合蛋白的荧光信号显示，蛋白的荧光信号和ER（内质网）标志蛋白重叠，暗示三者之间的相互作用发生在内置网上与核糖体相关。GUS染色，qRT-PCR分析AET1，RACK1A以及eIF3h三个基因的mRNA表达量，三个基因在所有的组织当中具有广泛表达，证明三个蛋白相互作用和广泛的蛋白合成相关。
图3. AET1与ER中RACK1A和eIF3h相互作用
4.AET1而不是RACK1A以及eIF3h直接和OsARF mRNA结合
AET1与RACK1A以及eIF3h的结合是否和mRNA相关？RIP测序（云序生物提供）帮助研究者快速的明确哪些mRNA能够和蛋白AET1结合，分析结果显示高温条件下545个mRNA分子只在野生型水稻株当中和AET1结合，而仅仅208个mRNA分子只在AET1突变植物当中和AET1蛋白结合，50个基因的mRNA分子在两个样本当中均发生结合。KEGG结果显示高温条件下野生型水稻株当中和AET1结合的mRNA的来源基因往往和光合作用以及代谢过程相关，而高温条件下只在AET1突变株当中结合的mRNA往往和氨基酸代谢通路相关。这些结果均显示AET1的功能丧失可以通过tRNA的表达分布的失衡从而影响蛋白的合成。比较有趣的是，热图提示高温条件下和植物生长素（auxin）相关的基因在野生型和突变型当中有明显的改变，OsARF基因发生了明显富集，暗示AET1基因可能是通过改变植物生长素信号通路来应对高温产生应答反应。
对RIP-seq结果进行进一步验证，RIP qPCR（云序生物可提供）结果显示OsARF19基因的上游开放阅读框（uORF）和下游主要开放阅读框（mORF）被明显富集，高温条件下的野生型和AET1突变型这两者的富集程度有所区别。之前的报道显示拟南芥当中，许多OsARF mRNA包含可以依赖eIF3h而抑制翻译的uORFs，作者推测在OsARFs基因当中的uORFs对mORFs的抑制作用也存在，通过预测，RIP-qPCR的进一步验证表明OsARF23 mRNA含有独特的“start-stop”uORF结构，AET1能够在高温环境下通过OsARF mRNA来调控auxin信号通路。最终结果证明，是AET1，而不是RACK1A或者eIF3h广泛的结合OsARF mRNA来调控OsARF mRNA的翻译过程。
图4. AET1与生长素响应因子的mRNA结合
5.AET1和RACK1A以及eIF3h共同调控OsARF mRNA的翻译效率
高温条件下OsARF19和OsARF23翻译效率均下降，通过CRISPR/Cas9对RACK1A eIF3h基因进行突变发现，相关基因有明显下降，植物的生长出现明显的缺陷，比如高度下降、种子产率低等等问题。AET1、eIF3h、RACK1A蛋白表达水平和mRNA转录水平保持一致，结果表明AET1蛋白可以明显的降低OsARF23蛋白的翻译效率，同时RACK1A以及eIF3h的敲除均能够引起OsARF23的表达下降。AET1突变水稻株对于外源性的auxin并不敏感，并且AET1基因使水稻对于高温有更好的适应能力。
图5. AET1与RACK1A和eIF3h一起调节OsARF mRNA的翻译效率
总结：
植物是无梗生物，因此进化出许多适应环境温度变化的策略。在本研究中，作者发现了一种名为AET1的鸟苷酰转移酶，它可以结合ER(内质网)中的RACK1A和elF3h蛋白，并与OsARF mRNAs紧密结合，从而调控相应的蛋白的翻译，使水稻对于高温有更好的适应能力。
全文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1674205219301625
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