云序客户8.0分成果揭秘：还愁lncRNA功能机制如何研究吗？
文章导读
LncRNA是长度大于200nt的长链非编码RNA，在调控不同的分子过程中发挥着重要作用。其主要功能不仅可以与功能蛋白结合，并在转录或转录后水平调控基因表达，而且lncRNA也可以作为诱饵，吸附miRNA，调节miRNA调控的靶基因表达。但是，目前关于lncRNA在胃癌中的表达谱和生物学功能的了解仍然有限；在本研究中，作者首先通过生物信息学分析胃癌lncRNA微阵列数据库，发现LINC0034在胃癌中显著高表达，且与胃癌具有临床相关性，结果显示显示LINC00346在胃癌中反复扩增上调，其表达与病理分期差、肿瘤体积大、预后差呈正相关。然后探究了 LINC00346的体内外功能，实验显示LINC00346能够影响胃癌生长、迁移和侵袭等生物学功能。作者也探究了LINC00346调控胃癌发展的上下游分子机制，上游机制显示致癌转录因子KLF5和MYC可与LINC00346启动子结合，并增强其表达；下游机制显示LINC00346主要表达在胞质中，可通过ceRNA机制作为miR-34a-5p的分子海绵体，并通过吸附miR-34a-5p后调节其下游靶基因CD44、AXL、NOTCH1的表达并调控胃癌细胞的生物学功能。
综上所述，该研究结果证明了KLF5、MYC/LINC00346/miR-34a-5p在胃癌发生发展中起关键作用的模型，为胃癌治疗提供了新方向和思路。
发表期刊：Cell Death & Differentiation
影响因子：8.0
实验方法：生信高级分析，转录组RNA测序，RIP，pulldown（云序生物提供）
测序样本：过表达LINC00346的胃癌细胞（实验组），转染空载质粒的胃癌细胞（对照组）
文章内容
1. 生物信息学分析胃癌lncRNA微阵列数据库，现LINC0034在胃癌中显著高表达，且与胃癌具有临床相关性
实验路线
结果：LINC0034具有胃癌临床相关性
a,b：LINC0034在胃癌中显著高表达；c-d：LINC0034的表达与病理分期差、肿瘤体积大、预后差呈正相关。
2．探究LINC00346在胃癌中的体内外功能
实验路线
结果1：体外探究LINC00346对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭功能影响
a-b．克隆形成实验探究细胞增殖能力；c. 流式细胞术实验探究细胞周期组织情况；d. EDU免疫荧光染色实验探究细胞增殖能力；e. Transwell和invasion实验探究细胞迁移和侵袭能力。
结果2：体内探究LINC00346对胃癌在体内的生长和转移的影响
a-h：裸鼠成瘤实验
3．探究LINC00346调控胃癌发展的上下游分子机制研究
实验路线
（1）LINC00346调控胃癌发展的上游机制
结果：转录因子KLF5和MYC可与LINC00346启动子结合，并增强其表达
a. 转录因子MYC、KLF5和 LINC00346的Oncoprint分析；b. 在含有或未含有胃癌KLF5/ MYC / LINC00346 SCNAs的转录因子KLF5、MYC、LINC00346基因表达；c. GSE51705数据库的分析显示，KATO-III GC细胞中KLF5与LINC00346基因启动子结合；d. UCSC基因组生物信息学网站显示， MYC高度富集在LINC00346的启动子上；e. GSE51575数据库显示LINC00346的表达与KLF5或MYC正相关；f. qPCR显示LINC00346的表达与KLF5或MYC 正相关；g. ChIP实验显示，内源性MYC和KLF5与LINC00346基因启动子区结合。h. WB显示干扰或过表达LINC00346后，KLF5和MYC蛋白表达情况；i. 双荧光报告实验检测LINC00346启动子片段与KLF5或MYC直接结合
（2）LINC00346调控胃癌发展的下游机制
结果1：GSEA和GO分析LINC00346高/低表达胃癌患者和细胞
a. GSEA分析GSE65801数据中比较LINC00346高/低后差异基因的富集信号通路； b. 热图显示胃癌中过表达LINC00346后的差异基因；c. GO分析差异基因的富集情况；d,e. qPCR和WB筛选肿瘤相关的差异基因。
结果2：LINC00346通过调节Notch1、CD44和AXL促进胃癌细胞增殖和侵袭
a.IHC分析肿瘤组织和肿瘤肺转移组织中Notch1, CD44, 和AXL的表达；b. qPCR检测胃癌发生或未发生淋巴结转移组织中Notch1, CD44, 和AXL的表达；c. IHC检测胃癌发生或未发生淋巴结转移组织中Notch1, CD44, 和AXL的表达；d. WB检测胃癌细胞中Notch1, CD44, 和AXL的蛋白表达；e,f. Transwell实验检测Notch1, CD44 或 AXL对LINC00346侵袭功能的挽救能力；g. MTT和h.克隆形成实验检测Notch1, CD44 或 AXL对INC00346增殖功能的挽救能力。
结果3：LINC00346通过与miR-34a-5p相互作用调控Notch1、CD44和AXL
a. LINC00346和miRNA结合位点的预测；b. MS2-RIP实验验证LINC00346能够拉下的miRNAs；c. pull-down实验验证LINC00346吸附的miRNAs；d. 双荧光报告基因实验miR-34a与LINC00346直接结合；e. AGO2 RIP实验验证miR-34a能够拉下LINC00346；f. WB显示miR-34a能够挽救LINC00346对Notch1, CD44 或 AXL的蛋白水平的调节；g. Tranwell实验显示miR-34a能够挽救LINC00346对胃癌细胞迁移和侵袭能力的调节；h. 双荧光报告基因实验显示miRNA能与Notch1, CD44 或 AXL基因的3‘UTR直接结合； i. 原位杂交实验显示LINC00346和miR-34a能够共定位在细胞质中。
总结
本研究通过生物信息学分析、功能实验和分子机制探究实验技术揭示了胃癌发展中一个潜在的新机制：在胃癌的发展过程中，转录因子KLF5和MYC结合LINC00346启动子区，并促进其表达；在胃癌中高表达的LINC00346主要定位在胞质中，并竞争性吸附miR-34a-5p，抑制miR-34a-5p对其下游靶基因（Notch1, AXL, 和CD44）的调控，最终导致了胃癌的恶化发展。LINC00346对胃癌细胞的促增殖和转移的多效性作用提示LINC00346可作为胃癌的有效治疗靶点。
全文链接：
https://doi.org/10.1038/s41418-018-0236-y
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RNA pull down
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