分子生物学常用实验技术（九）
第三节从动物组织提取基因组DNA
一、材料
哺乳动物新鲜组织。
二、设备
移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
三、试剂
1、分离缓冲液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶K (20mg/ml 或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
四、操作步骤:
1. 切取组织5g 左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml 分离缓冲液。
3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
4. 加50ul 或1mg 蛋白酶K, 37℃保温1-2 小时, 直到组织完全解体。
5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm 离心数秒钟。
6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm 离心5 分 钟。
7. 取上层水相至干净离心管, 加2 倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20 分钟，DNA 沉淀形成白色絮状物。
10. 用玻棒钩出DNA 沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE 中,-20℃保存。
11. 如果DNA 溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm 短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30 分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10 重沉淀DNA。
第四节细菌基因组DNA 的制备
一、材料
细菌培养物。
二、设备
移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。
三、试剂
1、CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl。
四、操作步骤：
1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm 离心10 分钟, 去上清液。
2. 加9.5ml TE 悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg 干粉)蛋白酶K, 混匀,37℃保温1 小时。
3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4. 加1.5ml CTAB/NaCl 溶液, 混匀, 65℃保温20 分钟。
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 离心10 分钟, 将上清液移至干净离心管。
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7. 加1 倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10 分钟，沉淀DNA。
8. 用玻棒捞出DNA 沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA 沉淀无法捞出,可5000rpm 离心, 使DNA 沉淀。
9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。
第五节基因组DNA 的检测
上述方法得到的DNA 一般可以用作Southern, RFLP、PCR 等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA 产量及质量均不同,有时DNA 中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR 的效果。所以获得基因组DNA 后,均需检测DNA 的产量和质量。
1. DNA 溶液稀释20-30 倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA 的含量和质量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose 胶上电泳, 检测DNA 的分子大小。
3.
取2μg DNA, 用10 单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose 胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA
必须完全酶解)。如果DNA 中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA 多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。
（2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。
（3）Sepharose 柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。
（4）CsCl 梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。
思考题:
1. 为什么构建DNA 文库时,一定要用大分子DNA？
2. 如何检测和保证DNA 的质量？
第七章RFLP 和RAPD 技术
第一节概述
DNA
分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment
LengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP
是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA
水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA
的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA
后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。运用随机引物扩增寻找多态性DNA
片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplifiedpolymorphic DNA
，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD 技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA
多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR
技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10 聚体)为引物,对所研究基因组DNA 进行PCR
扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA
多态性。RAPD 所用的一系列引物DNA 序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA
序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR
扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA
片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR
产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR 产物检测即可检出基因组DNA
的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD
可以对整个基因组DNA 进行多态性检测。另外，RAPD 片段克隆后可作为RFLP 的分子标记进行作图分析。本实验将学习RFLP
的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD 技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。
