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植物制片实验技术

2021.4.15


实验概要 植物制片技术是植物显微技术的一个重要组成部分,在有关植物形态建成、植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别以及林木材性鉴定等多方面的研究工作中,都需要应用显微制片技术,本实验介绍了植物制片基本方法。 主要试剂 1. FAA固定液(福尔马林-冰醋酸-酒精),又称万能固定液或称标准保全液。 适用范围:一般根、茎、叶、花药、子房的组织切片都可使用此固定液。 固定时间:一般需固定24小时,并可在此液中作较长期的保存,但温度宜低(10℃左右)。 配法: (1) 福尔马林(38%甲醛) 5mL (2) 冰醋酸 5mL (3) 70%酒精, 90mL 注意: (1) 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,以防止材料收缩。 (2) 制片时,材料不必洗涤,直接入70%酒精进行处理。 (3) 可加入5ml甘油(丙三醇),以防固定液蒸发和材料变硬。 (4) 此液兼有保存剂作用,故常采用。 2. FPA固定液固定时用丙酸代替冰醋酸,三种成分的用量同FAA,制片效果有时较FAA好。 3. CanoysFluid(卡诺氏液) 适用范围:穿透力迅速,常用于细胞学如根尖、花药的压片及子房石蜡切片等。 固定时间:根尖、花药可固定15分钟至30分钟,其他材料不超过24小时。 材料固定后,用95%、85%酒精浸洗,每级约20分钟,然后转入70%酒精中保存备用。 实验步骤 1. 杀生(杀死):在制片过程中,将拟制片的材料(细胞或组织块)迅速杀死,使组织块尽量保持原生活时状态,这种处理通称杀生。杀生时常用一种或多种化学药品处理。一般以渗透力较强的药剂作杀生剂效果较好。 2. 固定:在杀生处理的过程中,将器官、组织、细胞按原来的形态保存下来,并为后续制片保持固有形态,这样才达到固定的要求。杀生与固定关系密切,通常二者兼有作用。 3. 保存:组织块经杀生固定后,能较长时间保存下来,经久保存下来的组织块,仍能制片,如酒精、醋酸、福尔马林液保存时间较长,而铬酸类固定液,常须转换70%酒精液后保存,才可较长时间保存。 每种杀生与固定液都有其优缺点。有些杀生剂透入迅速,有些透入较慢,又有些透入虽快而会损害组织,为此人们在实践中常加其他药剂调节,或用水冲洗等,以弥补其不足。 在材料开始处理脱水前,需将组织块中含固定液冲洗掉,以便后续处理顺利进行。通常冲洗法如下: (1) 流水冲洗法:将医药用塑料小瓶,用烧红(酒精灯)了的解剖针,刺成无数小孔(孔的大小,由材料的大小决定),或剪去眼药瓶(塑料)的底部,焊上尼龙纱。冲洗前将材料倒入制成的滤器内,固定液漏下丢弃,加另一塑料盖,置广口瓶或培养缸内,以流水冲洗(自来水龙头上套一个连接头,也是用塑料眼药瓶剪去底部,再反装水龙头上,眼药瓶细嘴的一端,连接一个橡皮管,后将橡皮管通入装材料的瓶中,让流水徐徐从瓶底向上冲洗材料)。 (2) 静水洗涤法:如以酒精洗涤,或不能使用流水冲的材料(根尖、花药等)则用连续换洗来达到清洗目的,每次换液只需提起滤器,倾去旧液,换进新液。这种洗涤法的优点是:①不会损坏组织材料,②省时间省药品,提高工效和经济效益。凡经水至各级酒精脱水至70%酒精级时,材料可保存备用。 固定时,往往采用杀生与固定同时作用的混合固定液,其中药品常具平衡作用,如甲种药剂使细胞皱缩,加乙种药剂使其细胞膨胀,这种平衡固定液才宜使用,若两者对组织都不利,则一定不可采用,另对易氧化的药物不要与其他物质混合,因其还原力强,常使固定液发生变化而影响材料的固定,固定前材料存放器皿要根据材料大小性质进行选用。 注意事项 1. 要注意固定目的物本身的结构性质,以便选用适合的固定液,如一般根、茎、叶的组织切片用FAA,根尖、花药压片材料用卡诺民固定液,花药胚囊用纳瓦申(Navashin’s)液,茎尖(根尖)用铬酸-醋酸液。另外,固定时间的长短,要根据材料的特点而增减。 2. 固定微小材料可直接投入固定液中,对于较大材料,则须将其先解剖成较小材料,迅速投入固定液,以完成杀生固定作用。 3. 当体积较大的材料,出现外部已超过固定作用,而内部仍未达到固定目的时,必须考虑用透入快的固定液,如醋酸酒精或苦味酸蚁醛混合液。另外,加用超声波发生器处理数分钟,能达到迅速杀生的目的。 4. 对多毛的芽或根茎(菊科有的芽)固定时,须先投入醋酸酒精被中浸数分钟,然后再入纳瓦申液或其他固定液中,完成其固定作用,与此同时,还须进行抽气。另可用超声波发生器进行抽气固定。 5. 要考虑固定影像问题。一般固定液固定影像有两种类型。酸性固定影像对染色质、细胞核、纺锤丝等能保存,而对细胞质、核质、线粒体则溶解。盐基性固定影像对问期的染色质、纺锤丝溶解核质、线粒体则保全。 一般固定液多为酸性固定影像,盐基性固定影像较少。影像的形成并不完全按固定液的性质产生。同一种固定液,有时因材料的不同其影像有差异,因此,除考虑影像外,还应在脱水剂、渗入剂方面进行观察,适当选择,如同一种材料,用纯酒精与二甲苯脱水透明和用三丁醇脱水透明,两者所产生的影像是不相同的。 6. 固定剂的浓度,也是不可忽视的条件。 7. 材料的标记。固定标本瓶上,必须贴以标签,用碳素墨水书写以下内容:编号、采集时间、地点、处理者的姓名简写。另外,还需记采用何种固定液、何种保存液等内容。
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