放射免疫分析标记物的纯化及鉴定
(1)纯化
不论使用何种制备方法,要获得合格的标记化合物,都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外,一些标记化合物,经过一定时间的存放后,可发生脱碘和自身辐射造成蛋白质被破坏形成碎片,会出现不纯物,故需对标记物重新纯化。125I标记反应后的混合液需进行分离纯化以除去游离 I 和其他试剂,纯化标记物的方法有凝胶过滤法、离子交换色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法以及高效液相色谱法。
以葡聚糖凝胶(如Sephadex G-50)柱色谱分离纯化125I标记物为例:标记反应混合液经柱色谱时,需定时或定量逐管收集色谱洗脱液,并用γ计数仪测定每管的放射性强度。通常最先洗脱出的为聚合物杂质放射峰,然后为含标记物的主放射峰,随后即为游离125I-峰。
(2)鉴定
放射化学纯度指单位标记物中,结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率,一般要求大于95%。I标记化合物的主要质量指标有以下四项:标记化合物的放射性比活度、放射化学纯度、免疫活性、稳定性。
放射性比活性(specific radioactivity),是指单位化学量标记物中所含的放射性强度,也可理解为每分子被标记物平均所结合放射性原子数目,常用 a/g、mCi/mg 或 Ci/mmol 等单位表示。标记物放射性比活性较高时,可提高方法的灵敏度(相同放射性强度时,放射性比活性高者标记物用量少);但放射性比活性过高时,辐射自损伤大,标记物的免疫活性量易受影响,且贮存稳定性差。
依据标记反应中放射性核素的利用率(标记率)来计算:标记率=(标记抗原的总放射性/投入的总放射性)×100%=(投入的总放射性×标记率)/标记抗原量。该法计算操作简便易行,但影响因素多,结果欠精准。
免疫活性(immunoreactivity),反映标记过程中被标记物免疫活性的受损情况。方法是用少量的标记物与过量的抗体反应,然后测定与抗体结合部分(沉淀物,B)的放射性,并计算与加入标记物总放射性(T)的百分比(B/T,%),此值应大于80%,该值大,表示抗原损伤少。
