分子生物学常用实验技术（十四）
三、菌落原位杂交
对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。主平板应贮存于4℃直至得到筛选结果。
1、材料：待检测的细菌平皿，已标记好的探针，硝酸纤维素滤膜等。
2、设备：恒温烤箱，恒温水浴，台式高速离心机等。
3、试剂：
(1)LB 固体培养基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris?Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris?Cl。
预洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)预杂交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。其余试剂：与Southern 杂交相同。
4、操作步骤：
1. 将少数菌落转移到硝酸纤维素滤膜上：
(1) 在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜。
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm 的宽度。
(4) 用已装防水黑色绘图墨水的注射器针头穿透滤膜直至琼脂,在3 个以上的不对称位置作标记。在主平板大致相同的位置上也作上标记。
(5) 用Parafilm 膜封好主平板,倒置贮放于4℃,直至获得杂交反应的结果。裂解细菌,按本段下面所述方法,使释放的DNA 结合于硝酸纤维素滤膜。
2. 菌落的裂解及DNA 结合于硝酸纤维素滤膜
(1) 在一张保鲜膜上制作一个装有0.5mol/L NaOH 的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,将滤膜放到小洼上,展平保鲜膜,使滤膜均匀湿润,让滤膜留于原处2-3 分钟。
(2) 用干纸巾从滤膜的下方吸干滤膜,用一张新的保鲜膜和新配制的0.5mol/L NaOH 重复步骤(1)。
(3) 吸干滤膜,将滤膜转移到新的带有1mol/L Tris?Cl(pH7.4)的保鲜膜洼上。5 分钟后吸干滤膜, 再重复一次该步骤。
(4) 吸干滤膜,把它转移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris?Cl (pH7.4)的保鲜膜小洼上5 分钟后吸干滤膜,转移到一张干的滤纸上,置于室温20-30 分钟,使滤膜干燥。
(5) 将滤膜夹在两张干的滤纸之间,在真空烤箱中于80℃干烤2 小时,固定DNA。将固定在膜上的DNA 与32 P 标记的探针杂交。
５.杂交
(1) 盛有2×SSC 的塑料盘同，将干烤的滤膜飘浮在液面上,彻底浸湿5 分钟。
(2) 将滤膜转到200ml 预洗液的玻璃皿中。滤膜何叠在一起,放于溶液中。用保鲜膜盖住玻璃皿,放到位于培养箱内的旋转平台上。于50℃处理30 分钟。在这一步及以后的所有步骤中,应缓缓摇动滤膜,防止它们粘在一起。
(3) 用泡过预洗液的吸水棉纸轻轻地从膜表面拭去细菌碎片,以降低杂交背景而不影响阳性杂交
信号的强度和清晰度。
(4) 将滤膜转到盛有150ml 预杂交液的玻璃中,在适宜温度(即在水溶液中杂交时用68℃，而在
50%甲酰胺中杂交时用42℃)下,预杂交1-2 小时。
(5)
将32 P 标记的双链DNA 探针于100℃加热5
分钟,迅速置于冰浴中。单链探针不必变性。将探针加到杂交袋中杂交过夜。杂交期间，盛滤膜的容器应盖严，以防液体蒸发。杂交结束后,去除杂交液,立即于室温把滤膜放入大体积(300-500ml)的2×SSC
和0.1% SDS溶液中,轻轻振摇5 分钟，并将滤膜至少翻转一次。重复洗一次，同时应避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml
1×SSC 和0.1% SDS 溶液洗膜两次,每次1-1.5
小时。此时已可进行放射自显影。如背景很高或实验要求严格的洗膜条件,可用300-500ml 0.2×SSC 和0.1% SDS
的溶液于68℃将滤膜浸泡60
分钟。把滤膜放在纸巾上于室温晾干后,把滤膜(编号面朝上)放在一张保鲜膜上,并在保鲜膜上作几个不对称的标记,以使滤膜与放射性自显影片位置对应。
(9) 用第二张保鲜膜盖住滤膜。加X 光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16 小时。
(10) 底片显影后,在底片上贴一张透明硬纸片。在纸上标记阳性杂交信号的位置,同时在不对称分布点的位置上作出标记。可从底片上取下透明纸,通过对比纸上的点与琼脂上的点来鉴定阳性菌落。
四、斑点杂交
斑点杂交是指将DNA
或RNA 样品直接点在硝酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA
或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA 或RNA
的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。
1、材料：待分析的DNA 或RNA 样品，已标记的探针。
2、设备：狭槽点样器，真空泵，恒温水浴，真空烤箱等。
3、试剂：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纤维素滤膜。
（6）滤纸。
4、操作步骤：
(1) 10μl 样品与20μl 100%甲酰胺、7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC 混合。混合置于68℃，15分钟后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH 清洗点样器,再用无菌水充分冲洗。将一张经20×SSC 浸润的滤纸铺在点样器上,上面再铺上一张经20×SSC 浸润1 小时的硝酸纤维素滤膜，加盖并夹紧，接通真空泵。
(3) 用10×SSC 清洗各样孔。在每一样品中加两倍体积的2×SSC,混合后加样于孔中。外围几个孔中加2μl 染料定位,缓慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC 清洗两次。继续抽吸5 分钟,吸干滤膜。
(4) 取出滤膜,夹在两张滤纸中间, 80℃真空烘干2 小时。按上述Southern 或Norhtern 杂交所述的方法与放射性标记探针杂交。
[注意]
1、在放射自显影时应注意滤膜必须干燥，并覆盖上保鲜膜，否则，滤膜将与X-光片粘在一起，使以后的操作困难。
2、在杂交过程中，整个滤膜应一直是湿润的，不得干涸。第三节杂交反应的条件及参数的优化
不同的反应条件对杂交结果的影响如下：
(1) 根据杂交液的体积确定杂交的时间：一般来说使用较小体积的杂交液比较好，因为在小体积溶液中，核酸重新配对的速度快、探针用量少，从而使滤膜上的DNA 在反应中起主要作用。但在杂交中必须保证有足够的杂交溶液覆盖杂交膜。
(2) 根据所用的杂交溶液确定杂交的温度：一般来说，杂交相为水溶液时,则在68℃杂交,而在50%甲酰胺溶液中时,则在42℃下杂交。
(3)
选用不同的封闭试剂：如Denhardt's 试剂、肝素或一种由5%脱脂奶粉组成的BLOTTO, 这些试剂中需加入断裂的鲑鱼精子DNA
或酵母DNA，并和SDS 一起使用。与Denhardt's 试剂相比,BLOTTO 价格便宜,使用方便,同样可获得满意的结果，但它不能用于RNA
杂交。一般而言,尼龙膜用Denhardt's 试剂比用BLOTTO
能得到更高的信噪比。对硝酸纤维素滤膜而言,通常在预杂交溶液和杂交溶液中都含有封闭剂。但是对尼龙膜，经常从杂交溶液中省去封闭剂，因为高浓度的蛋白质会干扰探针和目的基因的退火。
(4)根据需要在杂交过程中选用不同的振荡方法和程度,许多杂交膜一起反应时,连续的轻微振荡可获得较好的杂交结果。
(5)
在杂交过程中加入其他化合物, 如反应体系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 杂交速度可增加约10
倍。检测稀有序列时常用该方法，但它们有时会导致本底较高，并由于溶液的粘稠性而使操作困难。因此，除非在滤膜上含有的目的DNA
量很少,或放射性探针的量有限,
一般不用硫酸葡聚糖或PEG。根据探针与被检测目标之间的同源程度选择清洗的程度,如具有很高的同源性可选用严紧型洗脱方式（高浓度SSC）,
反之则选用非严紧型洗脱方式（低浓度SSC）。洗脱通常在低于杂交体解链温度12-20℃的条件下进行。解链温度(melting
temperature, Tm )是指在双链DNA 或RNA 分子变性形成分开的单链时光吸收度增加的中点处温度。通常富含G?C
碱基对的序列比富含A?T 碱基对序列的Tm 温度高。有关Tm 的计算方法，请参考第八章。
(7)
根据标记探针的浓度及其比活性,选择不同的杂交条件及检测方法。一般使用新的同位素可获得较强的信号。在水溶液中杂交时,用6×SSC 或6×SSPE
溶液的效果都一样。但在甲酰胺溶液中杂交时,应该用具有更强缓冲能力的6×SSPE。上述这些条件的改变，对杂交的结果有不同的影响，应根据研究的具体情况，选用适当的方法。
思考题：
1、核酸探针的标记方法有哪些？
2、要获得好的杂交结果，需注意哪些因素？
3、如果放射自显影后，如X-光片背景很黑，请分析原因及写出预防措施。
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