SSR分子标记技术及其在构建玉米DNA指纹库上的应用2
2玉米DNA指纹库的构建
2． 1利用SSR分子标记构建玉米DNA指纹库
目 前，国内外对玉米种质鉴定采用的遗传标记仍以形态标记为主，参考同工酶和种子贮藏蛋白标记。但形态标记的表现受环境影响较大，鉴定工作量大，周期长，受季 节限制。同工酶和种子贮藏蛋白标记多态性不够丰富，同工酶还存在组织和器官特异性，取材有严格的一致性要求，所以鉴定结果不够稳定。近年来发展较快的分子 标记是以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳定遗传，可反映生物的个体和群体特征。由于它直接反映DNA水平上的差异，具有高度的专一性和特异性，不同物种、同一物种不同品种所得DNA指纹各异，就像人类的指纹一样，成为当今最先进的指纹鉴定技术。一种理想的分子标记应具有以下特点：多态性高；重复性和稳定性好；带型清晰，容易统计；在染色体上均匀分布；中性；共显性；简单快速，易自动化；开发和使用成本低廉。DNA指纹技术的发展日新月异，除以Southern杂交为基础的RFLP外，近几年已发展出了多种以PCR为基础的新的DNA指纹技术，如RAPD、AFLP、SSR、SCAR和ISSR等及以单核苷酸多态性为基础的SNP技术。但是，不同分子标记的应用价值不同(袁力行等，2000；Saliba-(Mombani et a1.,2000)。RFLP技术多态性较低，遗传信息有限，需要的DNA模板量大，而且操作复杂。RAPD技术尽管具有简单易行、需DNA量少、自动化程度高和实验周期短的优点，但对反应条件较敏感，重复性差。AFLP具有多态性高和稳定性好的优点，但所需DNA模板量大，操作步骤复杂，同时它还是ZL技术。与其他标记相比，以微卫星序列为基础的SSR标记在DNA指纹库构建上显示了独特的优越性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量大；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验室重复并共享(李新海等，2000)。虽然SSR引物的开发费用相当高，但由于其巨大的应用潜力，在一些主要农作物中SSR引物的开发正在进行中。目前，在玉米上已公开的SSR引物序列已达1800多对，并且每隔一段时间就有新的引物增加，为该技术在玉米DNA指纹图谱中的应用提供了良好的条件。
2．2玉米DNA指纹库构建的意义及其作用
我国国家种质库目前已搜集整理玉米种质15967份，在生产上每年种植面积在5万亩以上的玉米杂交种约300个，已申请植物新品种保护的玉米杂交种和自交系1000多个，每年参加国家区试及各省市预试的品种数以千计，通过国家和各省市审定的品种数百个(孙世贤等，2005)。 同时，由于少数骨干亲本的集中应用，玉米品种间的遗传差异越来越小，加之随着转基因等新技术在玉米育种中的应用，在原品种基础上仅改良少数甚至单个性状的 依赖性派生品种将增多。上述诸方面因素使得完全根据形态性状进行玉米品种的辨别越来越困难，给品种资源的收集、整理、鉴定筛选及品种的选育、保护及玉米开 发中的种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难。鉴于上述种种问题，急需从DNA分子水平给予每个玉米杂交种和自交系以一个能够准确表明其身份的身份证号码。与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，而且具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，这是品种鉴定实现产业化的前提，也是品种鉴定技术的发展趋势。
2．2．1玉米的品种鉴定及保护
在同一物种中的各个品种存在大量的多态性标记，某一品种具有区别于其他品种的独特标记即一些特异性DNA片段的组合就称为该品种的“指纹”，各品种的独特的指纹片段构成该物种的DNA指纹库，它具有类似于人的指纹那样的高度个体特异性和稳定性。DNA指纹库在作物育种中有着广泛应用：第一，每个品种DNA指纹差异可直接提供与目标性状有关的DNA水平的信息，避免了环境的干扰，从而能大大提高杂交种育种中对亲本及后代理想单株的选择效率；第二，通过检测品种是否具有该品种特有的标记指纹片段，可以有效地鉴定品种纯度与真伪以及用于新品种登记和品种知识产权保护等。在已有的DNA指纹技术和应用基础上进行我国玉米品种标准DNA指纹库构建的研究，这对保护玉米育成品种的知识产权和育种家的权益、提高种子市场的种子质量具有重要意义。
2．2．2纯度及真伪检测
在玉米杂交种生产与销售过程中，建立以质量检测为中心的良种繁育与种子管理体系，对稳定和推广优良品种起着重要作用。在国际标准及国家标准中，均采用种子纯度、净度、发芽率和水分4个质量特性来衡量种子质量并以此定级。在这4项指标中，尤以品种纯度为最重要。目前，我国玉米种子纯度鉴定仍以形态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定为主，辅以同工酶和蛋白质电泳技术。然而，玉米品种数量越来越多，种质基础却越来越狭窄，原有的检测方法已不能满足实际需要，实践中迫切需要开发新的检测技术。DNA指纹技术因其分辨率高、重复性好和简单快速等优点适应了这一需求。
2.2.3国家区试品种质量监控
DNA指纹技术在国家区试中主要应用于以下3个方面：
(1)供 试组合的一致性检测。如果供试组合本身不具有一致性，就失去作为一个品种的最基本条件，不能称为一个品种，当然也就没有进行区试的必要。实践中，某些育种 者为了尽快推出品种，可能用未完全纯合的早代系组配组合，这样的组合在若干性状上尚未稳定，不宜在生产中推广。如果能在区试之前或早期就将这类组合剔除， 将减少许多不必要的工作，使有限的资源集中到有希望的组合上。利用形态性状检测因周期长(至少一个生长季)无法起到预控的作用，只有DNA指纹技术才可能做到这一点。
(2)监 控组合在不同区试年份是否发生更换。实践中，某些育种者对第一年区试表现不是十分突出的组合，在第二年区试时用另一个组合代替。在很多情况下，两个组合具 有一个共同亲本或亲缘关系较近，因此形态性状上差别不太明显，不易区别。如何防止这种情况发生，保证区试的公正性和严肃性，是区试工作中面临的重要问题之 一。DNA指纹技术的高鉴别能力适应了这一需要。
(3)在区试的同时进行品种权测试。品种区域试验和品种权测试具有密切的联系，二者是相辅相成的。但目前国内现状是品种权测试与区域试验各自进行，互无关 系，造成人力和物力的巨大浪费。一些专家提出应将二者有机结合，同时进行，使一套试验满足两个目标的要求(孙世贤等，2003)。但在具体工作中如何操 作，仍是一个值得深入探讨的问题。利用DNA指纹技术进行区试品种的品种权测试提供了一个可行的实施方式。2002年初步构建了54份京津唐和黄淮海区试 品种的DNA指纹图谱；2003年对进入第二年区试的11份京津唐和黄淮海区试品种进行了一致性检测，并对同一份品种两年区试的DNA指纹进行了比较(赵 久然等，2003)。
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