转基因食品检验分析技术方法介绍
根据检验技术所依据的原理,可以将目前的技术大致分为以下几种。
1、依赖于GMO中DNA成分的PCR技术
PCR 是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)的简称。它模拟 DNA 聚合酶在生物体内的催化作用,在体外进行特异 DNA 序列的聚合及扩增。PCR 简便、快速,可以在一只小小的离心管中,短短的几小时内使某特异 DNA 片段扩增数万倍,所需的 DNA 模板量仅为10ng 以内,而且使用粗提的 DNA 就可以获得良好的扩增效果,因而这一技术的出现为外源基因整合的检测提供了便利的条件,尤其是在转化材料少又需要及早检测的情况下。但是,由于 PCR 扩增的高度灵敏性,有时会出现假阳性扩增,因此,常常使 PCR 与其他技术结合,目前常用的 PCR 种类有:普通 PCR、槽式 PCR、多引物 PCR、定量 PCR、PCR-ELISA 等。
PCR 反应具有高度特异性和敏感性,只需对少量的 DNA 进行测定便可检测 GMO 成分,但对实验技术的要求很高,其结果易受许多因素的干扰而产生误差,如操作人员移液时的误差、器皿用品的交叉污染等等,还有 PCR 反应体系存在的抑制因素也可带来干扰,一般PCR 只用作转基因食品的定性筛选检测。
针对所存在的问题,研究人员在实验设计中引入内部参照反应,以消除检测时的干扰,并与已知含量的系列 GMO 标准样的 PCR 结果进行比较,从而可以半定量地检测待测样品的GMO 含量。建立内部参照反应体系利用高纯度的 pBI 121质粒(含两个35S 启动子),以相同的引物对其 DNA 扩增可产生两条带,一为与常规35S启动子一致的195bp 带,另一为500bp 带,是 DNA 链上两个35S 启动子之间的序列扩增的产物。将此质粒 DNA 与待测样品 DNA 以同一对引物共扩增,分析扩增结果,有助于减少实验中的误差,得到可靠的半定量结果。但是,虽然半定量竞争 PCR 法在实验中对 PCR 模板量有所确定,在PCR 反应中引入质粒的双35S 启动子 DNA 进行共扩增,以帮助消除反应中未知因素带来的假阴性现象,但是其实验原理与常规的定性 PCR 筛选原理基本相同,对 GMO 含量的确定是与参考标准样的比较而定,检测结果的准确程度取决于实验者,不同实验室或重复实验的结果都可能会有差别,因而此方法仍未达到定量检测 GMO 含量的要求,仅作为半定量方法使用。此方法操作较为方便,但准确性较低。
PCR-ELISA-也是一种半定量检测方法,其基本原理是:利用共价交联在 PCR 管壁上的寡核苷酸作为固相引物,在 Taq 酶作用下,以目标核酸为模板进行扩增,产物一部分交联在管壁上,为固相产物,一部分游离于液体中,为液相产物。对于固相产物,可用标记探针与之杂交,再用碱性磷酸酯酶标记的链亲和素进行 ELISA 检测,同时可通过凝胶电泳对液相产物进行分析。PCR-ELISA 法将 PCR 扩增的高效性和 ELISA 的高特异性结合在一起,灵敏度高达0.1%,足以达到欧盟的要求(转基因检测阈值为1%);而且结果的判定通过紫外分光光度计或酶标仪,以数字的形式输出。与此同时,通过凝胶电泳对液相产物进行检测。两次检测有效地避免了假阳性出现,提高了检测结果的可靠性。
在此基础上,科学家发展了定量竞争 PCR 检测技术:先构建含有修饰过的内部标准 DNA片断(竞争 DNA),与待测 DNA 进行共扩增,因竞争 DNA 片断和待测 DNA 的大小不同,经琼脂糖凝胶可将两者分开,并可进行定量分析。取定量模板 DNA,所含 GMO 量分别为0～100%的系列参考样,分别与一定量的竞争 DNA 在同一反应体系进行PCR扩增。特异转基因 DNA 与竞争 DNA 竞争反应体系中的相同底物、引物,PCR 反应获得相差数十个碱基的两条凝胶电泳带,两条带浓度随转基因成分含量的不同而有差异。当两条带浓度相等,则说明此参考样 GMO 浓度与竞争 DNA 浓度相等。定量竞争 PCR 法的实验原理比较巧妙,实验程序设计较为严谨,采用构建的竞争 DNA 与样品 DNA 在同一体系中相互竞争相同底物和引物,并根据电泳结果做工作曲线图,从而得到可靠的定量分析结果。1998年欧盟的12个实验室共同对竞争 PCR 法进行了研究,结果表明竞争 PCR 法与定性PCR 法相比大大降低了实验空间的实验误差,竞争 PCR 法完全可以对转基因食品的 GMO 含量进行检测,包括有关法规确定的 GMO 含量的下限量。此方法对实验仪器要求不高,不足之处是需要用基因重组技术构建标准竞争 DNA,对一般实验室来说难度较大。
实时定量 PCR 法(real-time quantity)采用了与此不同的思路,即设计一个内部探针,该探针包含5′端荧光报告因子和3′端猝灭因子。PCR 反应前,由于猝灭因子与荧光报告因子的位置相近,使荧光受到抑制而检测不到荧光信号。随着 PCR 反应从上游的 PCR 引物开始,引物和标记探针与目标 DNA 分子中对应的互补序列复性,聚合酶与探针相遇,利用其5核酸外切酶活性使报告因子释放,产生的荧光可被内设的激光器记录,记录到的荧光强度可反映PCR的产物量,从而实现实时定量分析。实时定量法的灵敏度至少是竞争 PCR的10倍,可检测到每克样品中2pg 转基因的 DNA 量。该实验操作自动化,检测信号具有特异性,对未加工、加工和混合的样品都可检测。已有实验室用实时定量法作 GMO 定量筛选的检测方法,但对方法的标准化研究仍有待加强。缺点是需要购买价格昂贵的专门仪器,较难推广。
2、免疫学方法
免疫学方法主要是利用抗体可以特异地与抗原分子(GMO 蛋白成分)结合,因此通过抗原抗体的特异性识别反应来进行检测,是一种特异而简便的检测程序。目前,人们发明了许多种不同的方法来检测抗体与其目标抗原的结合,酶联免疫吸附测定(ELISA)就是其中的一种方法。在酶联免疫测定的过程中,抗体上通常还连接有一种酶,如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等,这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转化为有色物质。如果样品中带有目标分子,抗体上连带的酶就能够将无色的底物转变成有色物质,通过颜色的变化就能判断出被测样品中是否含有目标分子。目前,美国 SDI 公司已获得孟山都公司导入基因和蛋白使用权,开发出利用免疫技术的试剂盒“Trait 大豆 bulktest”和“GMO 大豆试剂盒”。
3、核酸杂交技术
核酸杂交技术的基本原理是两条 DNA 链之间可以通过碱基配对而形成氢键,通常核酸杂交的检测过程主要包括以下几个步骤:将单链的目的 DNA 结合到膜上,然后加入单链、标记过的探针 DNA,在一定的温度条件和离子浓度下使探针分子与目标 DNA 分子碱基配对,再洗去未结合的标记探针,检测探针和目标 DNA 形成的杂合分子。由此可以看出,一个核酸杂交检测有三个关键因素:探针 DNA、目的 DNA 和信号检测。把握好这三个因素,核酸杂交技术可以达到高特异性和高灵敏度的水平。
4、生物传感器和生物芯片技术
随着转基因产品种类的不断增加,过去所建立的转基因检测方法将难于适应未来的发展需要,因为这些方法均是一次对单个或少数几个基因的检测,而近年的热点—基因芯片检测方法将极可能成为未来对转基因成分检测的发展方向。基因芯片,又称 DNA 芯片或 DNA阵列,它与我们日常所说的计算机芯片非常相似,是成千上万的网格状密集排列的基因探针。它通过已知碱基顺序的 DNA 片段,来结合碱基互补序列的单链 DNA,从而确定相应的序列。通过基因芯片可以一次对数万种转基因成分进行检测。尽管该方法目前还存在灵敏度偏低、稳定性差、价格昂贵、离实际应用还有一段距离等缺点,但在不远的将来将取得突破性的进展。
如同所有的新技术那样,转基因技术也如同一把“双刃剑”,既有利也有弊,它对于食品安全分析有着极其重要的意义。
