植物表达载体的构建
实验概要
本实验介绍了一种构建植物表达载体的方法。
实验步骤
1. 植物正义表达载体的构建
1) 用SmaI和SacI双酶切pTriplEx2-GhMT3a和植物表达载体pBI121：
2) 进行琼脂糖凝胶电泳，回收GhMT3a片段和pBI121载体；
3) 连接：连接体系为：
混匀后4-160C连接过夜；
5) 转化：取5ul连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素的固体LB平板上；
6) 重组子的筛选：对长出的菌落进行PCR及酶切鉴定。
2. 农杆菌感受态细胞制备及转化
感受态细胞的制备：
1) 挑取农杆菌GV3101单菌落，接种于5m1LB液体培养基中，28℃，过夜培养；
2) 取2 ml培养物至液体LB中，继续培养至OD600为0.5左右；
3) 将培养物冰浴30 min，4℃，5000 rpm，离心5 min；
4) 弃上清，10 ml 0.1 M冷NaCl悬浮菌体，4℃，5000rpm，离心5 min；
5) 弃上清，1 ml 20 mM冷CaCl2悬浮，分装成200ul/管，液氮中冷冻后-80℃保存。
冻融法转化农杆菌：
1) 冰上融化感受态细胞，加入1-2ul重组质粒DNA，冰浴45 min，液氮中冷冻1 min再37℃水浴5 min；
2) 加入1 ml无抗生素的LB，28℃，200 rpm，3 h；
3) 12000 rpm，离心1 min以浓缩菌液，100ul回溶菌体；
4) 将菌液涂于含有50 mg/l卡那霉素的固体LB培养基上，28℃，培养2-3 d ；
5) 通过菌落PCR筛选阳性克隆。
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