直接原位PCR
实验方法原理 原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。
实验材料 细胞或组织样品
试剂、试剂盒 福尔马林二甲苯PBSTris-HCl Triton-X100蛋白酶KPCR反应缓冲液Tag酶Tween-20指甲油无水乙醇苏木素染色液 NP-40NaClMgCl2BSADAB过氧化氢盐酸酒精液
仪器、耗材 玻片湿盒滤纸显微镜
实验步骤
一、组织切片和细胞样品的制备
1. 试剂与配置
10%福尔马林；二甲苯；PBS。
2. 操作方法
（1）用10%福尔马林固定组织8~15 h，石蜡包埋，切片（4 μm），将切片置于新鲜的二甲苯中处理5 min，放入无水乙醇中浸泡5 min，取出，空气干燥；
（2） 对于培养细胞，可直接制备爬片，也可有PBS洗细胞一次，加10%福尔马林静置过夜，用橡胶刮下细胞；用PBS洗细胞两次，2 000 rpm×3 min，用5 ml PBS重悬细胞，即可用甩片机甩片或直接吸50 μl点在载玻片上。
二、切片预处理（蛋白酶消化）
1. 试剂与配置
0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)
缓冲液A：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，0.3% Tween-20，0.5% NP-40
蛋白酶K：20-50μ g/ml，溶于TE中
2. 操作方法
（1）干燥后的切片置于0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)中，室温孵育5 min；
（2）浸入缓冲液A中，室温孵育10 min；
（3） 滴加20 μl蛋白酶K液于标本上，在湿盒中37℃孵育20 min；
（4）在室温下，用0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.4)漂洗两次，每次5m in。
三、原位扩增（以标记生物素为例）
1. 试剂与配置
PCR反应缓冲液：两种引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol， Bio-dUTP 50mol，1×PCR缓冲液；
Tag酶：5U/μl
缓冲液B：0.01mol/L PBS，0.1% Triton-X100
指甲油（市售）
无水乙醇
2. 操作方法
（1）切片用1×PCR缓冲液平衡3次，每次5 min；
（2） 用滤纸吸去切片上多余的液体，置60℃，每片加入30 μl PCR反应缓冲液，5 U Tag酶，用盖玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸发；
（3） 94℃变性5 min，按下列条件（94℃×2 min，55℃×2 min，72℃×3 min）循环20~25次后，72℃延伸5 min；
（4）玻片浸入无水乙醇中10 min，以软化指甲油；
（5） 用刀片撬开盖玻片并除去；
（6） 用缓冲液B漂洗两次，每次3 min；
（7）用无水乙醇固定5 min，并吹干。
四、检测（以ABC法为例）
1. 试剂与配置
缓冲液C：0.1 mol/L Tris-HCl (pH7.5)，0.1 mol/LNaCl，2 mmol/L MgCl2， 0.5% Triton-X100
封闭液：3%BSA（溶于缓冲液C中）
显色液：0.05%DAB，溶于0.05 mol/L Tris-HCl (pH7.4)，临用前每10 ml加30%过氧化氢50 μl。
1%盐酸酒精液
苏木素染色液
2. 操作方法
（1） 用30 μl 3%BSA滴加在玻片上，封闭1 h；
（2）用缓冲液C简洗1 min，每片滴加ABC复合物20～30 μl，室温放置40 min；
（3）缓冲液B室温漂洗3次，每次15 min；
（4） 滴加显色液于玻片上，镜下观察控制显色时间（一般7～14 min）；
（5）流水洗片，浸入苏木素液中复染30 s，1%盐酸酒精分化（提抽2次）；
（6） 常规脱水、透明、封片，镜下观察。
