使用SpectraMax M5e读板机进行HTRF cAMP dynamic 2和IP-One检测 一
简介
SpectraMax® M5e多功能微孔板读板机具有双单色器，能够进行荧光、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振、光吸收和化学发光检测。它具有HTRF®(均相时间分辨荧光)认证的优势，使得生命科学和药物发现研究者们通过TRF检测的高度灵活性提高产出。
HTRF®是Cisbio Bioassays公司开发的一项检测生物分子相互作用的多用途技术1。此技术结合了荧光共振能量转移(FRET)和TRF的特点，采用铕(Eu)的穴状化合物作为供体荧光基团和一种经过修饰的别藻蓝蛋白(XL665)或小分子d2作为受体荧光基团。当标记了铕穴状化合物和d2的生物分子相互作用时，FRET就会在供体和受体荧光基团间发生，可在665nm处检测到荧光发射，此时大部分穴状化合物的激发能量都以620nm荧光发射释放出来。孔与孔之间的差异通过利用CisbioZL的HTRF比值算法校正，此算法使用的是665nm和620nm的荧光信号比值。
HTRF测定在SpectraMax M5e读板机上的表现通过使用两种不同的HTRF检测试剂展示。G-蛋白偶联受体信号转导通过检测两种主要通路，cAMP的调控和IP3介导的胞内钙离子水平增加。利用cAMPdynamic 2试剂中Eu的穴状化合物标记的单克隆抗-cAMP抗体和d2-标记的cAMP进行检测。由细胞本身产生的cAMP与cAMP-d2竞争结合抗-cAMP抗体穴状化合物。细胞内cAMP的增加导致FRET降低，检测到的665nm荧光下降了。IP-One测定采用相似的方式并使用IP1特异的单克隆抗体，一种稳定的在氯化锂存在下富集于信号转导细胞中的IP3下游代谢产物。665nm荧光与IP1浓度在校准品或细胞裂解物中成反比。这篇应用文献展示了两种基于细胞的检测数据和由cAMP dynamic 2和IP-One试剂盒得到的标准曲线。这些HTRF数据揭示了在SpectraMax M5e读板机上得到的完美动态范围和Z’ 因子。
优势
- 于双单色器系统的灵活性
- 极宽的动态范围和完美的Z’因子
- SoftMax Pro自带预设HTRF实验模板
材料
- cAMP dynamic 2 试剂盒，1000个测试(Cisbio cat. #62AM4PEB)
- IP-One 试剂盒, 1000个测试(Cisbio cat. #62IP1PEB)
- 细胞系：CHO-M1 (M1WT3;ATCC cat. #CRL-1985)
- 福斯高林(Sigma cat. #F3917)
- 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX;Sigma cat. #I7018)
- 氯化氨甲酰胆碱(碳酰胆碱;Sigma cat. #C4382)
- 白色384-孔微孔板(Corning cat. #3705)
- SpectraMax M5e多功能微孔板读板机(Molecular Devices)
注意：通常在SpectraMax M5e上检测HTRF使用的是白色微孔板。为优化信号检测，使用不透明白色微孔板而非底透板。
方法
cAMP dynamic 2测定
CHO-M1细胞生长于添加了10% FBS、1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺和200 μg/mLG418的Ham F12培养基中。使用悬浮细胞进行cAMP dynamic 2测定。细胞于测定当天进行胰酶消化，重悬于无添加的Ham F12培养基中，并以每孔4,000细胞、10 μL体积接种于白色384-孔微孔板中。为了刺激cAMP产生，添加检测试剂前用10 μL终浓度为3 nM到1 mM福斯高林处理处理细胞一小时。测试孔中加入0.5 mMIBMX以抑制磷酸二酯酶介导的cAMP降解。
福斯高林处理一小时后，按照产品说明书中所述加入cAMP-d2、裂解缓冲液和抗-cAMP抗体-穴状化合物。细胞阴性质控包含接受了抗-cAMP抗体-穴状化合物、偶联物及不含cAMP-d2的裂解缓冲液的未处理细胞。FRET阴性质控对Delta F值的计算是必要的，其在HTRF产品说明书中有所强调3。所有样品和标准品的最终测定体积为40 μL，但是测定体积可以针对不同微孔板类型调整。
标准品按照cAMP dynamic 2 HTRF产品说明书所述准备。cAMP终浓度从0.17到 712nM，并且包括不含cAMP(最大FRET)的阳性质控。包含自由cAMP的质控用于检测测定的活性，不含cAMP或cAMP-d2的阴性质控(无FRET)用于计算DeltaF。cAMP-d2添加于所有标准品和阳性质控中，而接受有偶联物的阴性质控和裂解缓冲液没有cAMP-d2。抗-cAMP抗体-穴状化合物添加于所有标准品和质控中。室温下孵育一小时后，在SpectraMax M5e读板机上进行微孔板读数。(请见表1 仪器设置)。
