使用SpectraMax M5e读板机进行HTRF cAMP dynamic 2和IP-One检测 二
IP-One测定
CHO-M1细胞按上述方法培养。在测定前一天，细胞以每孔10,000?40,000接种于含有完全生长培养基的384-孔微孔板中。第二天，使用浓度范围从15 nM到33 μM的碳酰胆碱刺激细胞(刺激缓冲液包含用于准备碳酰胆碱浓度的氯化锂溶液)。刺激一小时后，IP1-d2偶联物、裂解缓冲液和抗-IP1抗体-穴状化合物添加于孔中。细胞阴性质控包含接受了抗-IP1抗体-穴状化合物、偶联物和不含IP1-d2的裂解缓冲液的未处理细胞。最终测定体积为40 μL，但是此cAMP测定可针对不同的微孔板类型调整体积。
根据IP-One HTRF产品说明书所述在刺激缓冲液中溶解IP1标准品，使IP1标准品终浓度范围从21.5到22,000 nM 4。孵育阳性IP1和不含IP1的阴性质控。IP1-d2添加于所有标准品和阳性IP1质控中，而接受了偶联物的阴性质控和裂解缓冲液不含IP1-d2。抗-IP1抗体抗体-穴状化合物添加于所有样品中。室温孵育一小时后，根据表1中的设置在SpectraMax M5e读板机上进行微孔板读数。
数据分析
根据Cisbio的指南使用SoftMax? Pro软件对cAMP和IP-One进行数据分析。SoftMax Pro软件中的4个不同的HTRF预设实验模板专为各种现阶段可用类型的HTRF测定设计以简化数据采集和分析。
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