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使用SpectraMax微孔板读板机检测Quant-iT PicoGreen dsDNA实验一

2020.5.05

简介

双链DNA通常使用微孔板读板机通过测量DNA溶液的260nm吸收光进行定量。然而，这种方法通常在微孔板读板机上只能检测到最低250ng/mL的浓度。对于生物学应用涉及到小体积样品，如新一代测序和扩增产物定量时，更灵敏的方法才能满足需求。Life Technologies公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA实验对于DNA的特异性更好且比传统的吸收光方法灵敏1000倍。产品信息中标称在微孔板上进行此实验，使用单一染料浓度时动态区间可达250pg/mL到1000ng/mL。1此篇应用文章展示使用Molecular Devices公司SpectraMax®荧光微孔板读板机和Quant-iT PicoGreen实验，用户能稳定的检测低至100pg/mL的双链DNA。

为了最大化实验的灵敏度，使用最优的激发和发射波长是必要的。不像基于滤色片的读板机，SpectraMax微孔板读板机的双光栅允许用户选择仪器标称范围内任意波长。确定能产生最佳实验动态区间的激发和发射波长是很重要的，因为这会与基于滤色片的读板机有一定区别。

SpectraMax M5荧光微孔板读板机的最优激发和发射波长如下：490nm激发和525nm发射，515nm发射截取滤色片(注意这些波长可能与Quant-iT PicoGreen产品说明书中针对基于滤色片读板机的波长有所不同)。SoftMax®Pro软件中有预设程序用来获取，展示和分析来自SpectraMax系列读板机的数据。

优势

- 灵敏的荧光定量低至 63 pg/mL的DNA
- 线性动态范围跨四个数量级
- 通过SoftMax Pro软件中预设的程序简单的分析结果

材料

- Quant-iT PicoGreen dsDNA实验试剂盒，包含l ambda DNA标准品(Life Technologies 货号 #P7589或P11496)
- 褐色96-孔板(Greiner Bio-One, 货号#655096)
- 棕色或琥珀色 (避光离心管）
- Molecular Devices 带荧光检测模式的微孔板读板机:
- S pectraMax® M3/M4/M5/M5e(cat. #M3 or #M4 or #M5 or M5E)
- SpectraMax® i3x (cat. #i3x)
- S pectraMax® M2/M2e(cat. #M2 or M2E)
- Gemini XPS/EM (cat. #XPS or EM)
- FlexStation® 3 (cat. #FLEX3)
- FilterMax F3/F5 (cat. #F3 or F5)
- S pectraMax® Paradigm(cat. #PARADIGM)
- SoftMax® Pro软件(Molecular Devices)

方法

仪器设置

- 将微孔板读板机开机。
- 启动SoftMax Pro软件并在Protocols下拉菜单中打开 PicoGreen荧光程序。针对实验最优的设置已包含在程序中(见Table 1)。通过点击“Settings”并在屏幕左侧选择需要读取的孔并和实验板类型。
- 点击“Template”按钮来打开窗口，在窗口中您可以分配多孔板的孔到预设模板的相应组中。可以使用下拉菜单来选择合适的模板组。荧光程序中有多个预设的模板组，包含Standards,Unknowns,和Unknowns_NoDiln (对应稀释的样品)。分配孔到当前模板的组中会将程序组表格中所对应的微孔板读取时获得的数据进行分组。

准备实验

实验方法遵循QuantiT PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒中产品信息页中的指导，除了实验体积按比例从2.0mL减到200μL来适应96孔微孔板格式。

- 通过使用无DNA酶水20倍稀释试剂盒中的浓缩缓冲液制备1XTE缓冲液(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)。
- 使用TE缓冲液(上面制备的)200倍稀释浓缩的Quant-iT PicoGreen试剂DMSO溶液来制备水相工作液。推荐在塑料容器中而不是在玻璃容器中制备此溶液，因为试剂有可能吸附在玻璃表面上。通过使用琥珀色或棕色管或用金属箔包裹将试剂避光。应在试剂制备后几小时内使用。
- DNA标准曲线：用TE缓冲液制备2μg/mLdsDNA储液。试剂盒中提供的ambdaDNA标准品可以通过使用TE稀释50倍来制成2μg/mL溶液。