如何利用微孔读板机进行微量DNA和蛋白的高通量检测？
介绍
在遗传学和分子生物学中，对核酸和蛋白进行定量是许多复杂实验必要的上游检测。虽然已有多种检测方法，但是最常用的仍然是紫外分光光度法。紫外分光光度法的原理是利用分子在固定波长范围吸收光和散射光，在朗伯比尔定律(方程式1)的基础上计算待测物质的浓度。这种方法还需要提前知道样品的摩尔消光系数和通路长度。
A = εcL
方程式1：朗伯比尔定律是指吸光度(A)等于分子摩尔消光系数(ε)乘以浓度(c)和通路长度(L)。变换等式后我们可以利用吸光度来计算浓度。
核酸定量已经是一门非常成熟的检测技术了，并且与最初相比其检测原理并未发生太多的改变。我们可以在260nm波长下检测核酸浓度，并且可以利用230nm和280nm波长检测样本纯度。
我们同样可以用紫外分光光度法对蛋白质样本进行定量，然而除此之外还有更多更准确的比色测定法。紫外分光光度法利用色氨酸的芳香结构特性吸收280nm波长的光，浓度的计算依赖于氨基酸序列上的不同含量的色氨酸残基。另外，二喹啉甲酸(BCA)蛋白实验可以在不依赖于氨基酸序列和长度的情况下检测蛋白浓度。此方法是在碱性条件下利用双缩脲反应使氨基酸骨架和铜离子形成带颜色的螯合物进行测定的。
SpectraMax® ABS Plus 是一款理想的进行这些定量实验的紫外可见光谱微孔读板机。在这里，我们展示了几种不同的将ABS Plus reader 和 SpectraDropTM MicroVolume Microplate and SoftMax® ProSoftware 相结合用来定量检测双链 DNA和牛血清白蛋白 ( BSA ) 的方法。
优势
- 更宽的波长检测范围：190 - 1000 nm
- 配合使用超微量板可大大节省样品的上样量
- SoftMax Pro 软件预置模板使得操作更加简便
材料
- SpectraMax ABS Plus 微孔板读板机(Molecular Devices cat. #ABS Plus)
- SpectraDrop 超微量板 (Molecular Devices cat. #0200-6262)
- 96 孔平底透明塑料板 (Greiner Bio-Onecat. #655101)
- UltraPureTM 小牛胸腺 DNA 溶液 (ThermoFisher Scientific cat. #15633019)
- Pierce BCA 蛋白质定量试剂盒 (ThermoFisher Scientific cat. #23225)
- PierceTM 牛血清蛋白标准品 Ampules, 2mg/mL (ThermoFisher Scientific cat.#23209)
- UV-Star® 96 孔板 (Greiner Bio-Onecat. #655801)
方法
DNA 定量
1000 ng/μL 的超纯小牛胸腺双链 DNA，用1x PBS 倍比稀释。将 2 或 4 μL 样品加入 64 孔 SpectraDrop 微量板中，并用0.5 mm 或 1.0 mm 盖玻片盖住样品。打开 SoftMax Pro 软件中预先设置好的程序“SpectraDrop DNA Quantitation”，按照默认设置对板进行读数。数据结果用双对数曲线进行表示，SoftMax Pro 软件会进一步生成标准曲线。另外，通过范围为 220 nm 至 350 nm，步进为 4 mm 的光谱扫描可以检测样品纯度。
我们也比较了运用比色皿和微孔板进行DNA 定量检测的优劣。待测样品按照倍比稀释为 250 ng/μL 至 0.5 ng/μL，然后加入紫外透明 96 孔微孔板中 ( 每孔 200μL )或者紫外可见比色皿中 (1000 μL)。我们用 SpectraMax ABS Plus 微孔读板机在 260 nm 对样本进行了检测。数据结果用双对数曲线进行表示，SoftMax Pro 软件会进一步生成标准曲线。
蛋白质定量
按照 BCA 实验试剂盒提供的步骤稀释蛋白样本并做标准曲线。将 25 μL 蛋白标准品和 200 μL BCA 反应液加入 96 孔微孔板中37°C 孵育 30 min。用 SoftMax Pro 软件打开预设程序“BCA”，在 562 nm 波长条件下读数。数据用二次方曲线拟合，进而用 SoftMax Pro 软件生成标准曲线。
结果
ABS Plus 微孔读板机可以在微量和标准微孔板条件下定量检测双链 DNA 浓度。利用SpectraDrop 微量板和预设程序，ABS Plus微孔读板机可以检测到浓度低至 2 ng/μL体积为 4 μL 的样本，并且可以同时测量计算相关参数如 A260 / A280 和 A260 / A230 比例 ( 图 1 和 图 2 )。光谱扫描可以进一步检测样本是否被污染 ( 图 3 )。另外，ABSPlus 微孔读板机可以用微孔板方法对双链DNA 定量。利用紫外区透光型微孔板，读板机可以检测浓度低至 0.02 ng/μL 的双链DNA ( 图 4 )。最后，SpectraMax ABSPlus 微孔读板机可以在 BCA 浓度测定法的基础上检测蛋白浓度。按照试剂盒说明书的步骤检测 BSA 标准品浓度并绘制标准曲线 ( 图 5 )。
结论
SpectraMax ABS Plus 微孔读板机是一款简单可靠的仪器，支持多种检测方法，如比色皿和微孔板，进行核酸和蛋白质定量的微孔板检测仪器。如果和 SpectraDrop超微量板搭配使用，此读板机可以一次定量 64 个体积低至 2 μL 的样本。另外，SoftMax Pro 软件的预设模板程序可以优化实验条件并且能更快得到结果。
-
企业风采
