利用SpectraMax i3x多功能微孔板读板机检测功能对...（一）

2020.6.02

利用SpectraMax i3x多功能微孔板读板机检测功能对于细胞活力和细胞毒性的评价

优势

1.仪器具有超高灵敏度化学发光检测功能，最低至10个细胞/每孔

2.微孔板读板高度自动优化设置，可提高检测信号强度软件预置

3.软件预置模板可以更快分析出检测结果

简介

SpectraMax i3x是Molecular Devices公司最新推出的一款多功能微孔板读板机，可利用仪器所具有的化学发光检测功能，进行细胞活力和细胞毒性相应检测。仪器可灵敏、快速检测出培养基中活细胞的数目和经相应处理后细胞毒性情况。Promega公司推出的CellTiter-Glo试剂是利用了萤火虫荧光素酶反应体系中需要ATP参与才能使其发光的特点，化学发光信号强弱取决于培养基中ATP含量的高低，也就是依赖于其中活细胞数目的多少。来自于BioVision公司基于生物化学发光原理的细胞毒性检测试剂盒，目的是检测腺苷酸激酶(AK)的含量，AK为一种存在于所有细胞中的常见蛋白，当破坏了细胞膜完整性后其会释放至培养基中，AK可转化ADP至ATP，所以可以利用类似方式进行化学发光检测。

材料

. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega P/N G7570)

. Bioluminescence Cytotoxicity Assay Kit (BioVision P/N K312-500)

. HeLa .细胞(ATCC P/N CCL-2)

. 黑色底透 96孔细胞培养板(Corning P/N 3904)

. 白色96孔细胞培养板(Corning P/N 3917)

. SpectraMax i3x多功能微孔板读板机

方法

准备试剂

使用前预先将CellTiter-Glo缓冲液和底物解冻并且平衡其至室温，将CellTiter-Glo缓冲液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色小瓶中，按照试剂盒说明书提示，将试剂轻轻反复颠倒进行混匀。对于生物化学发光细胞毒性检测试剂盒，其中包含了1瓶AK检测试剂，此试剂使用前预先将1.1ml AK试剂缓冲液加入其中并轻轻混匀，需在室温环境下平衡15分钟后使用。这个10X的AK试剂的储存液需要稀释后才能成为试剂缓冲液。

细胞数目与化学发光信号关系

Hela 细胞培养在含有10%胎牛血清和双抗的MEM培养基中，细胞经胰酶消化后，使其悬浮于培养基中进行计数。处理后的细胞铺在96孔板中，经细胞培养基稀释后其密度从50,000细胞每孔/100ul至10个细胞每孔/100ul。如果将细胞铺在384孔板时，稀释后密度从12,500细胞每孔/25ul至6个细胞每孔/25ul。对照孔中仅需加入细胞培养基用于检测其背景的化学发光信号值。

细胞试验过程中，精确的细胞数目可用于生成标准曲线，将不同体积的CellTiter-Glo试剂加入相应的孔板中，如100ul(96孔板)或25ul(384孔板)。将微孔板放置于振荡器上轻混2分后，室温条件下孵育10分钟，等化学发光信号值稳定后再进行检测。

ATP标准曲线

ATP以1:10稀释度进行稀释后加入96孔板和384孔板中，浓度从10uM至1nM，不加细胞的孔作为空白孔。CellTiter-Glo试剂可用于检测ATP，检测前可利用SpectrMax i3x具有的微孔板优化设置和读取高度优化设置功能，帮助你获得更佳信号值。

细胞活力和细胞毒性试验

将Hela细胞预铺在白色底透的细胞培养型96孔板中，密度为15,000/孔，培养过夜。第二天在细胞孔中加入十字孢碱(staurosporine)和茴香霉素(anisomycin)这两种化合物来诱导细胞凋亡。这两种化合物起始浓度都为50uM，并以1:2方式稀释至24nM。再经过24小时孵育以后，分别使用CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒和BioVision的细胞毒性检测试剂盒对处理后的细胞进行检测。

对于CellTiter-Glo细胞活力检测试验，将100ul的CellTiter-Glo试剂加入含有细胞的白色微孔板中，等10分钟左右，当细胞彻底裂解以后再进行相应检测。

对于BioVision细胞毒性检测试验，每孔中取100ul处理后的细胞培养基，将其转移至白色微孔板中，并在白色微孔板中加入100ul的AK工作液，此方法需要在30分钟内完成检测。

仪器设置和结果分析

SpectraMax i3x读板机参数设置如表一所示。使用专业级别的SoftMax. pro软件后，可直接获得平均相对化学发光信号值(RLU)和标准偏差值。直接绘制出细胞稀释度曲线和ATP标准曲线，选择其中的4参数拟合方式进行拟合后快速计算出其IC₅₀值。软件预置模板库中还有针对CellTiter-Glo检测试验的模板可方便直接调用。