蛋白质凝胶染色法实验3
糖蛋白的检测
1. 通用糖蛋白检测
糖 基 化 是 真 核 细 胞 中 最 常 见 的 蛋 白 质 翻 译 后 修 饰 。寡 糖 通 常 连 接 于 天 冬 酰 胺 侧 链(iV-连 接 糖 基 化 ) 或 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 羟 基 侧 链 (〇 连 接 糖 基 化）。凝 胶 中 蛋 白 质 电 泳 后 染色 时 ，通 常 先 用 高 碘 酸 氧 化 邻 近 的 糖 基 ，然 后 根 据 希 夫 碱 机 制 进 行 酰 肼 结 合 。
显 色 ：酸 性 品 红 染 色 剂
市 面 上 可 以 买 到 的 试 剂 盒 都 是 基 于 一 种 利 用 酸 性 品 红 染 色 剂（Zzcharius et al. ，1969) 的 显 色 方 法 ，包 括 G e l c o d e ( T h e r m o Scientific) 和 Glyco-P r o (Sig m a-Aldricli) 糖蛋白染 色 试 剂 盒 。凝 胶 在 5 0 % 甲 醇 中 固 定 、清 洗 ，并 在 1 % 高 碘 酸 盐 中 孵 育 从 而 氧 化 邻 近 的 糖基 ，再 清 洗 ，用 品 红 亚 硫 酸 盐 试 剂 孵 育 ，在 还 原 剂 (偏 亚 硫 酸 氢 钠 或 硼 氢 化 钠）中 孵 育 ，清洗 ，再 保 存 在 稀 乙 酸 中 。糖 蛋 白 指 示 通 过 品 红 条 带 完 成 ，品 红 条 带 在 染 色 反 应 进 行 时 开 始出 现 ，随 后 显 色 缓 慢 增 强 。
荧 光 通 用 糖 蛋 白 染 色 剂
Pro-Q E m e r a l d 300 和 P r o - Q Emerald 488 糖 蛋 白 凝 胶 染 色 试 剂 盒（Life Technologies; 数 字 表 示 各 自 的 常 用 激 发 光 源）、K r y p t o n 糖 蛋 白 染 色 试 剂 盒（T h e r m o ScientificPierce) 和 Glycoprofile III 荧 光 糖 蛋 白 染 色 试 剂 盒（S i gma-Aldrich) 均 是 利 用 高 碘 酸 盐 氧
化 后 与 荧 光 酰 肼 结 合 而 进 行 染 色 。使 用 这 些 试 剂 盒 时 , 不 需 要 进 行 后 续 的 还 原 反 应 (如 和偏亚硫酸氢钠进行还原反应）。
大 多 数 可 买 到 的 荧 光 酰 肼 都 有 自 发 荧 光 。亮 绿 荧 光 的 P r o - Q Em e r a l d 3 0 0 酰 肼 试 剂在 溶 液 中 不 显 荧 光 , 在 同 小 分 子 醛 结 合 时 就 显 弱 荧 光 性 。染 色 后 的 糖 蛋 白 条 带 是 亮 绿 色的 ，结 合 后 的 染 料 可 作 为 成 核 位 点 使 溶 液 中 浓 度 接 近 饱 和 的 自 由 试 剂 沉 淀（H a u g l a n det al. ，2005)。 P r o - Q Emerald 3 0 0 和 P r o - Q E m erald 4 8 8 糖 蛋 白 染 料 试 剂 盒 的 使 用 已 有— 些 细 节 方 面 的 讨 论（Hart et al. ，2003;Steinberg et aL ,2001)。这 些 研 究 发 现 了 P r o - QE m e r a l d 3 0 0 糖 蛋 白 染 料 是 最 灵 敏 的 选 择 性 糖 蛋 白 染 料 ，在 使 用 时 却 只 适 用 于 紫 外 线 光源 。研 究 中 的 数 据 和 观 察 结 果 都 突 出 表 明 ，许 多 荧 光 酰 肼 会 显 示 总 蛋 白 质 的 非 特 异 染 色 。此 外 ，染 料 稀 释 液 组 分 也 会 影 响 其 选 择 性 。通 过 选 择 那 些 已 经 充 分 了 解 其 特 性 的 蛋 白 质
和 /或 通 过 糖 苷 酶 消 化 后 的 样 品 ，以 此 作 为 含 有 蛋 白 质 的 已 知 糖 基 化 状 态 的 对 照 ，在 待 测样 品 电 泳 时 将 其 作 为 对 照 泳 道 是 很 有 帮 助 的 。未 经 高 碘 酸 盐 氧 化 的 平 行 胶 也 许 可 以 指 示固 有 的 非 特 异 蛋 白 质 染 色 ，或 是 由 于 其 他 氧 化 反 应 而 造 成 的 内 源 醛 或 酮 的 染 色 。最 后 需要 注 意 的 是 ，通 过 突 光 扫 描 仪 可 以 检 测 出 酸 性 品 红 亚 硫 酸 盐 染 色 的 蛋 白 质 条 带 。扫 描 仪
需 532 n m 激 光 和 675 n m 长 通 过 滤 镜 ，比 起 可 见 的 色 度 法 极 限 ，其 敏 感 度 增 加 2〜4 倍 。
2. O 型 N-乙酰氨基葡萄糖的检测
叠氣化物-炔烃” 点 击 化 学 “试剂
许多蛋白质经 N -乙酰氨基葡萄糖 (O G l c N A c ) 以 P-连接方式 O 型连接到丝氨酸和苏氨酸残基上，从而获得显著的修饰。这种翻译后修饰体现了可控方式下磷酸化作用的位点特异的相互性。因 此 O O l c N A c 糖基化可能扮演一种动态「阴-阳」角色 ，介 导磷酸化调节的信号，以及其他特异的蛋白质信号 (Golks and Guerini，2008;H a r t ，1999)。从历史上看 ，基于凝胶的 O G l c N A c 检测仍有一定问题，但如今已经可以实现用于凝胶检测的敏感的 O G l c N A c 特异荧光标记。
这一方法是基于铜 (I) 催化的叠氮化物和炔烃间的 H u i sgen [ 3 + 2 ] 环加成反应，是一种 「点击化学」反 应（A g n e w et al. ，2 〇 08;Clark et al. ,2008)。 蛋白 质 （于纯化的任意阶段 ) 经 Click-iT O G l c N A c 酶标系统 (Life Technologies) 酶促标记 (4 〇 C 过夜），这种标记使用的是一种允许条件下的突变 型 浐 I ，4-半乳糖基转移酶 (Gal-Tl Y 289L ) ，这种酶可以将U D P -半乳糖中的叠氮化物修饰的半乳糖 (G a I N A z ) 转移到目标蛋白质的〇 型 JV-乙酰氨基葡萄糖残基上（Ramakrishnan and Q a s b a , 2 〇〇 2 )。 叠氮化物修饰的 O G IcNAc 糖基化的蛋白质随后经铜 (I) 催化的点击反应被荧光标记，该反应使用的是四甲基罗丹明-炔烃(T A M R A -alkyne) 或 Dapoxyl 炔 烃 染 料 ，染 料 各 自 为 CUck-It T A M R A 或 Click-iTD a p o x y l 蛋白质分析检测试剂盒 （Life Technologies) 中的催化试剂。被标记的蛋白质经S D S -P A G E 被 分 离 , 再通过适当仪器进行图像采 集 。 酶标试剂盒含有一种阳性对照蛋白质 w 晶型。该 技 术 已 被证明可利用 T A M A R 炔烃检测试剂来检测微型凝胶中的 1 〇〜40u mol 的 O G IcNAc，并且可与下游的质谱分析相兼容。被标记的蛋白质同样可以用总蛋白质染色剂或其他翻译后修饰—特 异 的 染 色 剂 （如 P r o - Q D i a m o n d 磷蛋白染色剂或
P r o —— Q Emerald 3 0 0 糖蛋白染色剂) 染色。
