蛋白质凝胶染色法实验（五）
磷 蛋 白 的 检 测
作为基本的细胞信号机制,
指定氨基酸残基的可逆磷酸化作用的重要性已无需争辩。当前磷蛋白染料具有受ZL保护的构型，即磷酸基结合部分共价连接于荧光团。检测的方式是选择性结合磷酸化的氨基酸，但是没有荧光增强作用。从某种程度上讲,
许多可溶的荧光复合物都可作为总蛋白质染色剂。一种选择性磷蛋白染料需要含有一个磷酸基结合部分、一个对总蛋白质的自发突光很低的荧光团 、 一
种可抑制非特异性总蛋白质染色的组分及一个促进残余的非特异染色解离的脱色方案。每个多肽中与总蛋白质染色剂靶定
的氨基酸数量相比，靶定的磷酸基仅有少数。磷蛋白检测敏感性通常和用胶体考马斯染色
剂 或 SYPRO O range 染 色 剂进行总蛋白质检测时处于同一水平，而不及银染剂或SYPRO Ruby
染色剂那么敏感。凝胶中蛋白质磷酸化检测需要有适当的对照，包括展示已知的磷酸化状态（阳性对照) 或去磷酸化状态（阴性对照）的蛋白质,
并且如果可以的话，还需有用活性憐酸酶对样品进行处理的对照。在检测到磷蛋白信号后，需要用一种总蛋白质染色剂对凝胶进行染色。市面上可以买到的磷蛋白染色剂可与随后的考马斯亮蓝染色剂、银染剂或总荧光染色剂
(如 SYPRO Ruby) 兼容, 但不能与依赖 SDS 的荧光染色剂(如 SYPRO Orange)
兼容。磷蛋白染料可与随后的分析步骤，如质谱分析或肽测序相兼容。
1.P r o - Q D i a m o n d 嶙蛋白凝胶染色剂
Pro-Q D i a m o n d 磷蛋白凝胶染色剂（Life Technologies) 系一种即用型配方，是根据磷酸肽 (p h o s p h o p 印 tide) 固定金属亲和层析的原理发明的，利用的是溶液中荧光团连接的金属螯合部分，这种溶液含金属离子、盐和可与水混溶的有机溶剂，用缓冲 液 调 p H 至4(A g n e W e tal.，2006)。这种染色方案需要在甲醇/乙酸溶液中固定，用水清洗以去除固定剂 ，用 P r o - Q D i a m o n d 配方进行染色，随后在含 1,2-丙二醇混合物中脱色，在乙腈中脱色效率更高 [如 50 m m o l /L 乙酸钠 (P H 4)、1 5 % 〜2 0 % 1,2-丙 二 醇 或 1 5 % 〜2 0 % 乙腈]。微型凝胶中的磷蛋白检测需至少 1〜2 n g 的丨酪蛋白（一种五磷酸化蛋白质) 或 8 n g 胃蛋白酶 (一种单憐酸化蛋白质），该检测法具有 1000 倍的线性动态检测范围。总蛋白质染色后，再 使 用 P r o - Q D i a m o n d 染色剂可得知蛋白质的体外磷酸化状态或去磷酸化状态。
2. Phos-t a g 磷蛋白染色剂
可以买到 P h o s -t a g 磷蛋白染色剂 (Perkin E l m e r) 的试剂盒包装, 其采用与 P r o - Q Dia m o n d 染色剂相同的通用染色策略，却有与之不同的缓冲液组分。 这些染色剂含有已有充分描述的 P h o s-t a g 结合部分，g 卩醇盐-桥的双核锌 (II) 配合物。该分子是根据可逆的磷酸锌 (II) 配合物的酶学原理设计的。解离常量为 25 n m o l /L 的 P h o s-t a g 苯基磷酸盐复合物与其他磷酸基结合部分的微摩尔解离常量的对比已有描述（Kinoshita et al. ,2004;K o i k e e t a L ，2007)。在某些情况下,Ph o s-t a g 技术对基于凝胶的磷蛋白分析比直接胶内憐蛋白染色更有效 (Kinoshita et al. ，2006; Y a m a d a et al. ，2007)。可买到的 Phos-tag 凝胶 染 色 剂 试 剂 盒 ，可 以 选 择 双 荧 光 ，最 大 激 发 光 谱 为 ： P h o s-t a g 磷 蛋 白 凝 胶 染 色 剂300 n m /460 n m (双激发最大值) 或 540 n m 。近期报道称，使 用 Phos-tag 300/460 染色剂来检测一种具细菌性应答调节子的天冬氨酸磷酸化 (BarHeri and Stock，2008)。
糖蛋白的检测
1. 通用糖蛋白检测
糖 基 化 是 真 核 细 胞 中 最 常 见 的 蛋 白 质 翻 译 后 修 饰 。寡 糖 通 常 连 接 于 天 冬 酰 胺 侧 链(iV-连 接 糖 基 化 ) 或 丝 氨 酸 和 苏 氨 酸 羟 基 侧 链 (〇 连 接 糖 基 化）。凝 胶 中 蛋 白 质 电 泳 后 染色 时 ，通 常 先 用 高 碘 酸 氧 化 邻 近 的 糖 基 ，然 后 根 据 希 夫 碱 机 制 进 行 酰 肼 结 合 。
显 色 ：酸 性 品 红 染 色 剂
市 面 上 可 以 买 到 的 试 剂 盒 都 是 基 于 一 种 利 用 酸 性 品 红 染 色 剂（Zzcharius et al. ，1969) 的 显 色 方 法 ，包 括 G e l c o d e ( T h e r m o Scientific) 和 Glyco-P r o (Sig m a-Aldricli) 糖蛋白染 色 试 剂 盒 。凝 胶 在 5 0 % 甲 醇 中 固 定 、清 洗 ，并 在 1 % 高 碘 酸 盐 中 孵 育 从 而 氧 化 邻 近 的 糖基 ，再 清 洗 ，用 品 红 亚 硫 酸 盐 试 剂 孵 育 ，在 还 原 剂 (偏 亚 硫 酸 氢 钠 或 硼 氢 化 钠）中 孵 育 ，清洗 ，再 保 存 在 稀 乙 酸 中 。糖 蛋 白 指 示 通 过 品 红 条 带 完 成 ，品 红 条 带 在 染 色 反 应 进 行 时 开 始出 现 ，随 后 显 色 缓 慢 增 强 。
荧 光 通 用 糖 蛋 白 染 色 剂
Pro-Q
E m e r a l d 300 和 P r o - Q Emerald 488 糖 蛋 白 凝 胶 染 色 试 剂 盒（Life
Technologies; 数 字 表 示 各 自 的 常 用 激 发 光 源）、K r y p t o n 糖 蛋 白 染 色 试 剂 盒（T
h e r m o ScientificPierce) 和 Glycoprofile III 荧 光 糖 蛋 白 染 色 试 剂 盒（S i
gma-Aldrich) 均 是 利 用 高 碘 酸 盐 氧
化 后 与 荧 光 酰 肼 结 合 而 进 行 染 色 。使 用 这 些 试 剂 盒 时 , 不 需 要 进 行 后 续 的 还 原 反 应 (如 和偏亚硫酸氢钠进行还原反应）。
大
多 数 可 买 到 的 荧 光 酰 肼 都 有 自 发 荧 光 。亮 绿 荧 光 的 P r o - Q Em e r a l d 3 0 0
酰 肼 试 剂在 溶 液 中 不 显 荧 光 , 在 同 小 分 子 醛 结 合 时 就 显 弱 荧 光 性 。染 色 后 的 糖 蛋 白 条
带 是 亮 绿 色的 ，结 合 后 的 染 料 可 作 为 成 核 位 点 使 溶 液 中 浓 度 接 近 饱 和 的 自 由 试 剂 沉
淀（H a u g l a n det al. ，2005)。 P r o - Q Emerald 3 0 0 和 P r o - Q E m
erald 4 8 8 糖 蛋 白 染 料 试 剂 盒 的 使 用 已 有— 些 细 节 方 面 的 讨 论（Hart et al.
，2003;Steinberg et aL ,2001)。这 些 研 究 发 现 了 P r o - QE m e r a l d 3 0 0 糖
蛋 白 染 料 是 最 灵 敏 的 选 择 性 糖 蛋 白 染 料 ，在 使 用 时 却 只 适 用 于 紫 外 线 光源 。研 究 中 的 数
据 和 观 察 结 果 都 突 出 表 明 ，许 多 荧 光 酰 肼 会 显 示 总 蛋 白 质 的 非 特 异 染 色 。此 外 ，染 料 稀
释 液 组 分 也 会 影 响 其 选 择 性 。通 过 选 择 那 些 已 经 充 分 了 解 其 特 性 的 蛋 白 质
和 /或 通
过 糖 苷 酶 消 化 后 的 样 品 ，以 此 作 为 含 有 蛋 白 质 的 已 知 糖 基 化 状 态 的 对 照 ，在 待 测样 品 电
泳 时 将 其 作 为 对 照 泳 道 是 很 有 帮 助 的 。未 经 高 碘 酸 盐 氧 化 的 平 行 胶 也 许 可 以 指 示固 有
的 非 特 异 蛋 白 质 染 色 ，或 是 由 于 其 他 氧 化 反 应 而 造 成 的 内 源 醛 或 酮 的 染 色 。最 后 需要 注
意 的 是 ，通 过 突 光 扫 描 仪 可 以 检 测 出 酸 性 品 红 亚 硫 酸 盐 染 色 的 蛋 白 质 条 带 。扫 描 仪
需 532 n m 激 光 和 675 n m 长 通 过 滤 镜 ，比 起 可 见 的 色 度 法 极 限 ，其 敏 感 度 增 加 2〜4 倍 。
2. O 型 N-乙酰氨基葡萄糖的检测
叠氣化物-炔烃” 点 击 化 学 “试剂
许多蛋白质经 N -乙酰氨基葡萄糖 (O G l c N A c ) 以 P-连接方式 O 型连接到丝氨酸和苏氨酸残基上，从而获得显著的修饰。这种翻译后修饰体现了可控方式下磷酸化作用的位点特异的相互性。因 此 O O l c N A c 糖基化可能扮演一种动态「阴-阳」角色 ，介 导磷酸化调节的信号，以及其他特异的蛋白质信号 (Golks and Guerini，2008;H a r t ，1999)。从历史上看 ，基于凝胶的 O G l c N A c 检测仍有一定问题，但如今已经可以实现用于凝胶检测的敏感的 O G l c N A c 特异荧光标记。
这一方法是基于铜
(I) 催化的叠氮化物和炔烃间的 H u i sgen [ 3 + 2 ] 环加成反应，是一种 「点击化学」反 应（A g n e w et
al. ，2 〇 08;Clark et al. ,2008)。 蛋白 质 （于纯化的任意阶段 ) 经 Click-iT O G l c N A
c 酶标系统 (Life Technologies) 酶促标记 (4 〇 C 过夜），这种标记使用的是一种允许条件下的突变 型 浐 I
，4-半乳糖基转移酶 (Gal-Tl Y 289L ) ，这种酶可以将U D P -半乳糖中的叠氮化物修饰的半乳糖 (G a I N A z )
转移到目标蛋白质的〇 型 JV-乙酰氨基葡萄糖残基上（Ramakrishnan and Q a s b a , 2 〇〇 2 )。
叠氮化物修饰的 O G IcNAc 糖基化的蛋白质随后经铜 (I) 催化的点击反应被荧光标记，该反应使用的是四甲基罗丹明-炔烃(T A M R A
-alkyne) 或 Dapoxyl 炔 烃 染 料 ，染 料 各 自 为 CUck-It T A M R A 或 Click-iTD a p
o x y l 蛋白质分析检测试剂盒 （Life Technologies) 中的催化试剂。被标记的蛋白质经S D S -P A G E 被 分
离 , 再通过适当仪器进行图像采 集 。 酶标试剂盒含有一种阳性对照蛋白质 w 晶型。该 技 术 已 被证明可利用 T A M A R
炔烃检测试剂来检测微型凝胶中的 1 〇〜40u mol 的 O G
IcNAc，并且可与下游的质谱分析相兼容。被标记的蛋白质同样可以用总蛋白质染色剂或其他翻译后修饰—特 异 的 染 色 剂 （如 P r o - Q
D i a m o n d 磷蛋白染色剂或
P r o —— Q Emerald 3 0 0 糖蛋白染色剂) 染色。
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