转基因小鼠模型的建立(SOP)-3
（2）受体母鼠的准备
输卵管转移的受体鼠应该为4-6周龄大小，体重在20-25克左右，严禁用低体重以及超重母鼠，若体重较低，其体能不足以维持妊娠，可能导致受精卵的重新吸收；若体重较重，麻醉剂被吸收入脂肪组织，降低麻醉效果，可能使手术困难，而且脂肪组织的存在意味着静脉的存在，所以手术时切掉脂肪组织可能导致不必要的出血，难以确认手术时的操作对象。出血也可能堵塞移卵管。选择输卵管转移前一天晚上与切除输精管小鼠交配的假孕母鼠，注射当天早上母鼠可见精栓。尽管像Swiss Webster系的哺育母鼠很容易超重，随着体重的增加，它们将表现出不同程度的感觉消失，但它们是优良的哺育母鼠。另外，它们的价格也便宜。另一个成功的鼠系是B6D2F1，它们生命力强并有一定杂合优势。
（3）麻醉剂：阿佛丁被证明是输卵管转移手术的有效麻醉剂。
（三）实验操作程序和方法
1．鼠系克隆
（1） 动情期的探测：在转基因动物模型的建立中母鼠动情期的监测有很高的技巧性。小鼠的动情期主要划分为四个时期：
① 动情后期：阴道口无扩张，周围组织为灰白色，阴道口周围无膨大
② 间情期：阴道开口小，周围组织为灰色或蓝色。
③ 动情前期：阴道口逐渐扩张，阴道周围组织由粉红色变为红色。
④ 动情期：阴道周围组织颜色由红色转为粉红色，阴道口背侧唇可见条
纹，阴道口腹侧唇可见肿大，阴道有分泌液外渗。
随机选择动物，任何时间都可能有20%-25%的动物处于动情期。大多鼠科动物的动情期平均持续4-5天，所以对群居性动物的个体进行动情周期的同步化处理后可能在任一时期产生大量发情动物。动情期动物的选择需两个指标：阴道周围组织色泽和组织膨胀的程度。动情期动物阴道组织深粉红色，但并不同于炎症时的色泽。另外，阴道口周围背腹部组织肿胀而有光泽，起初其腹部可见条纹。个别阴道口组织色泽较深，但无膨胀，或阴道口稍微扩大且略带灰色者为非动情期动物，切勿误选它们用于交配。
（2）交配的确认：阴栓形成。动物合笼后，确定雄性个体是否与母鼠成功交配非常有必要。由于雄性精液可在阴道内凝固成柔软栓性物，成功交配后不久有阴道栓形成。以手的中指、小指和拇指捏住雌性尾根处，使小鼠头部向下，仔细观察阴道口部位，交配过的雌性小鼠可见有白色橡皮擦状的阴道栓，易肉眼所见，难以确定时可用小探针检查阴道深部是否有栓子存在。检查阴栓应在每天早上的早些时间，因为随着时间的推移，阴栓将被排出体外。
2．输精管切除术：输精管切除小鼠用于与晶胚转移母鼠交配使母鼠假孕。小鼠6-8周龄进行输精管切除术，CD-1 B6D2F1(C57BL6 *DBA/2)或Swiss Webster系是通常的实验对象。阿佛丁腹腔注射麻醉剂量为240mg/kg。
（1） 称重后麻醉小鼠，背位固定小鼠，大剪刀贴近皮肤剪毛，70%的乙醇涂 搽消毒手术切口部位，以防止毛发污染切口。
（2） 于生殖器前方大约1.3cm处横行剪开下腹部皮肤，作约1cm的切口，
用浸70%乙醇的纱布搽拭切口部位以清理毛发。
（3） 切开腹膜，进行膀胱定位。每侧都可见有一条管道走行，用镊子轻轻夹
持左侧管道，提起部分使手术视野清晰可见，确定其为输精管。
（4） 将镊子插进输精管下方，使它们处于自然状态，其末端垂直。同时在该
位置两端用缝线结扎输精管，距离大约4-5毫米。在两结扎点间剪断输精管，置其于纱布上确定此侧手术完毕。
（5） 将输精管两个断端轻轻放回腹腔，如上处理右侧输精管。两侧手术完毕后，2-3根单独缝线缝合腹壁切口。待用缝线须浸泡在70%乙醇中，保持缝线湿润，防止结扎时粘附组织。用两个或三个自动小夹夹闭皮肤。
