转基因小鼠模型的建立(SOP)-4
（6） 为保暖包裹小鼠于纱布中或将其放置于热垫内使其苏醒，处于麻醉状态
下的小鼠应该严格监护直到其完全苏醒。手术后小鼠饲养2周后确定手术是否成功。
（7） 实验性饲养：将1-2只母鼠与输精管切除小鼠合笼饲养，次晨进行阴道栓检查。有阴道栓的母鼠，用磷酸缓冲液处理后24小时，其输卵管潮红。卵细胞应该处于单细胞期或未受孕状态，若处于双细胞期，则输精管切除未完全，雄性小鼠应进行再筛选。
3．受精卵的收集
（1）受精卵的采集：受精卵获得的方法分自然排卵和激素诱发排卵以及体外受精三种方法。本章对诱发排卵法给予介绍。
诱发排卵法：雌性小鼠生后6—8周达到性成熟，性周期均为4—5 日，其排卵时间可用饲养室的明亮和黑暗进行调节，所以必须对饲养室的明暗规律进行准确严格地管理。
性周期是卵泡刺激素和黄体生成素相互作用的结果，我们可以从外部给予这些激素诱发排卵。向成熟雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)之后，约在48—54h后再将2.5-5.0 IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔内，约12h后即可诱发排卵。排卵数量可达自然排卵的2倍，效果很好。雌小鼠给予hCG后应立刻与雄性合笼。成熟雄小鼠应按每笼饲养1只，雄性小鼠大小在12周龄到1年。合笼时，须将激素化雌性小鼠放进雄小鼠的笼中。雄小鼠释放促雌性发情的外激素，在交配过程中建议不换笼，交配过的雄小鼠，间隔一周后才进行下次交配。
显微注射的受精卵最好于交配后次晨注射前几小时收集，此时易进行注射操作。交配后过夜小鼠的阴道栓易见，可用交配指示剂指示。对超排卵的交配母鼠体内进行阴道栓计数一般正常。低比率的有栓母鼠说明促性腺激素失去效力或雄性小鼠交配过度或雄性小鼠老龄化。收获受精卵必须打开小鼠腹腔，输卵管必须仔细切开。输卵管冲洗术或输卵管壶部切开术都可作为收集受精卵的方法。
（2）腹腔内输卵管的切开
1） 通过断颈或二氧化碳吸入快速处死小鼠。
2） 将动物背位固定在无菌干燥的吸水纸上，剪毛并用70%的乙醇彻底涂搽手术部位。以避免毛发污染手术视野。
3） 持眼科镊捏紧下腹部正中线皮肤，用外科剪作小的横切口，剪刀钝性分离充分暴露手术视野，或钝性撕开皮肤暴露腹膜。用眼科剪打开腹膜，充分暴露腹腔与子宫角部手术视野。子宫为Y形，为起自盆腔膀胱后的肌性器官，向上分支为两侧子宫角，向上横行深入腹腔。
4） 用镊子距输卵管卵巢6-7mm处夹持子宫角翻转后轻轻拖出腹腔，在镊子捏点下部子宫角下方附近刺破肠系膜，清除肠系膜组织远离子宫角与输卵管，并防止用力过大压破子宫角与输卵管连接处。
5） 用镊子拖出脂肪垫，卵巢，输卵管以及子宫部件。小心剪掉卵巢与输卵管之间的薄层膜，然后剪下输卵管和部分子宫角，将其盛放在盛工作液的小玻璃皿中，对另一侧输卵管重复上面操作，完毕后如上处理下一只动物。
（3）离体输卵管内受精卵的收集：解剖镜下观察近输卵管漏斗部上部明显潮红此为壶腹部。用眼科镊子撕开膨大的壶腹部即看到包绕受精卵的丘细胞团。
1）转移输卵管于含工作液的小玻璃皿中。
2）眼科镊子夹持壶腹部，并用另一只眼科镊子撕开膨大的输卵管，游离的受精卵慢慢流出，也可以用镊子轻轻挤压输卵管将受精卵推出裂口。
（4）透明质酸酶处理与受精卵的漂洗
工作液中受精卵可能成团状，微注射用的受精卵必须是单个细胞，而且无细胞碎片。漂洗细胞时，首先用工作液除去细胞碎片。不成团细胞可用无菌移液管收集到盛工作液的玻璃小皿中，注意把握移液管的张力。溶解在工作液中的透明质酸酶对细胞团以及复合体进行消化时必须严密观察，一旦细胞团溶解立即将单细胞转移到新鲜工作液中，防止消化过度。
用工作液漂洗2-3次，清除碎片后，用无菌移液管将受精卵置于特殊培养基（M16），放于37?C, 5% CO2孵箱中待注射，此培养基上层覆盖高压消毒矿物油，可防止污染同时防止培养基水分蒸发影响pH。受精卵在体外发育较体内快，在孵育过程中注意观察一些受精卵清晰可见原核形成，在此期间可先选出原核清晰的卵(形态稍不规则)用于注射，其它卵继续培养。注射后，再筛选，再注射，直至得到满意的注射卵数。
