以人二倍体成纤维细胞W1 38 为例
一、实验组合 为证实被检物作用的确切性,应做如下实验组合安排
二、放射自显影法UDS 的测定 1. 细胞培养
WI-38 成纤维细胞,完全培养液支持物盖片培养法培养,细胞生长至汇合时; 2. 抑制DNA 合成
弃旧培养液,加入不含精氨酸的EMEM培养液,继续培养20~24 小时;
3. 加测试物
加入10 mM羟基脲(阳性对照加MNNG),培养2 小时;
4. H-TdR处理
2、3、4 每皿内加3H-TdR(5 μC/每皿)后,培养20~24 小时;
5. 漂洗
去除培养液,用不含钙、镁BSS漂洗;
6. 制片
制备放射自显影标本方法(参考原位杂交基因定位法)固定细胞、涂胶、曝光、显影及染色;
7. 观察
在油镜下计数,首先要排除S期半保留复制细胞(为银粒密集覆盖的细胞核),只计数核上的银粒数目,再扣除本底(每例计数30~50 个细胞),结果以银粒数/核的均值或含10 个银粒左右细胞的百分率表示。
三、液闪计数法
1. 细胞培养和处理
人二倍体成纤维细胞:接种在培养皿中培养;
2. 加培养液、MNNG、羟基脲,以及3H-TdR处理等与前5项相同,自5漂洗后;
3. 消化
用0.25 %胰蛋白酶消化、制成悬液;
4. 液闪计数标本制备
10 %三氯醋酸处理,将细胞收集在玻璃纤维滤纸片上,无水乙醇脱水烤干、置液闪杯中、加闪烁液、置液闪计数仪上计数;结果以dpm/106细胞或cpm/每皿细胞表示。 展开 |