cDNA文库的构建和筛选—在外界环境压力条件下，...（一）
cDNA文库的构建和筛选—在外界环境压力条件下，新表达基因的鉴定方法实验
实验步骤
一、材料
所有化学试剂均为分子生物学级纯度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头均经高压蒸气灭菌。涉及核酸的操作均需带手套。
1.总 RNA提取
（1）无 RNase 水。加 I mL 焦 炭 酸 二 乙 酯（DEPC) (Sigma-Aldrich) 到 I L 水中(0.1%， V/V) , 搅 拌 过 夜（> 1 2 h)，高压蒸气灭菌。这可使得存在于水中的RNase 失活，处理过的水用于本节中溶液的配制和溶解 RNA 样品。
（2）TRIzo〖试 剂（Invitrogen)。
（3）氣 仿（Fisher Scientific)。
（4）异 丙 醇（Fisher Scientific)。
（5）7 0 % 乙醇，加 30 mL DEPC 处理的水至 70 mL 无水乙醇中。
（6）Oligo (dT) 纤 维 素（New England BioLabs， NEB)。干燥的 Oligo (dT) 纤维素与 0 •I mol/L NaOH 混合使其成浆状，填充入一个无菌的柱子或 I mL 灭菌棉花或者玻璃丝塞住的注射器。在加样前先用上样缓冲液平衡柱子。
（7）上样缓冲液： lm ol/LNaCl， 2 mmol/L 磷酸缓冲液， PH7.2。
（8）洗漆缓冲液（middle wash buffer) : 上样缓冲液+0.3 mol,+LNaCl。
（9）洗脱缓冲液（elution buffer): 10 mmol/L Tris——HCl， pH7. 2〜7. 4 ， I mmol/LEDTA
（10）3 mol/L 乙酸钠， pH 5. 2。
（11）乙醇。
2 cDNA 文库的构建
3 CDNA 文库的扩增
（1）NZY 平 板（24 cmX24 cm )， LB-氛卞青霉素肉汤， XLl-Blue 菌种 ， NZY 琼脂，NZY 上 层 琼 脂（见 2 中 第 19、 20 项）。
（2）TSM 缓 冲 液（见 2 中 第 16 项）。
（3）氯 仿（Fisher Scientific)。
（4）二 甲 亚 讽（DMSO; Sigma-Aldrich)。
4 cDNA 文库差异表达的筛选
（1） NZY 平 板（24 cmX24 cm, 见 2 中第 19、 20 项）
（2）Hybond-14 0.45/1111 孔径的尼龙膜（GE Healthcare)。
（3）20XSSC: 3 mol/L NaCl， 0. 3 mol/L 柠 檬 酸 钠（I L 配方： 175 g NaCl， 88 g柠檬酸钠）；用蒸馏水稀释。
（4）变性缓冲液： I.5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L NaOH。
（5）中和缓冲液： I. 5 mol/L NaCl, 0. 5 mol/L Tris-HCl， pH 8. 0。
（6）冲洗缓冲液： 0.2mol/LTris-HCl， p H 8. 0, 2XSSC。
（7）Whatman 滤纸或层析纸（Fisher Scientific)。
（8）dNTPs (dATP、 dTTP、 dGTP 各 1 0 mmol/L)。
（9）固定的 Oligo (dT) 引物： 5’ - dT (15) A/G/C-3、 可 购 买 商 业 化 产 品（Invitrogen； New England Biolabs) 〇
（10）Nasin (20 U/μL, Promega)
（11）二 硫 苏 糖 醇（DTT) (Sigma-Aldrich)，用无菌水配置成〇• I m ol/L 储存液。
（12）A M V 反 转 录 酶（10 U/μL) 和 10X 反转录缓冲液（Promega)。
（13）[α-32P] dCTP (3000 Ci/mol; GE Healthcare) 。
（14）RNaseA (60 mg/mL, Sigma-Aldrich)0
（15）快 速 离 心 柱（quick spin column) (TE; Sephadex 0 2 5 ， Fine)，用于放射性标记的 DNA 纯 化（Roche)。
（16）IX T wEl 缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8. 0 ， I mmol/L EDTA。
（17）杂交缓冲液，改良的 Church’s 缓冲液： 0.25 mol/L Na2 HPO4, 0.25 mol/LNaH2 PO4 (PH 7. 5)， lmmol/LED TA， 7 % 十二烷基磺酸钠（SDS; W/V );或够买商业化的缓冲液； Ultrahybe (Ambion)。
（18）洗膜缓冲液（membrane washing buffer): 0. 1XSSC， 0 •1 % SDS (W/ V)。
（19）膜清洗缓冲液（membrane rinsing buffer): 0.1 X SSC。
（20）X 光 片（Koda)。
(21)TSM 缓冲液：（见 2 中第 16 项）。
(22)氯仿（Fisher Scientific)。
(23)XLl-Blue 培养基。
(24) N ZY 上 层 琼 脂（见 2 中第 19、 20 项）。
5菌体内克隆的检出
(1)XLl-Blue 菌种。
(2)10 mmol/L MgSO4。
(3)ExAssist helper 嗤菌体。
(4)Uni-ZAP X R 噬菌体储存液。
(5)LB- 氨苄青霉素肉汤（见 2 中第 18 项）。
(6)SOLR 细胞。
(7)L B 氨苄青霉素琼脂平板： 15 g 琼脂粉加至 L B 肉 汤 中（I L)，高压蒸气灭菌。冷却至 50°C 以下铺平板，加人氨苄西林（lOOpg/mL) , 用恰当厚度铺板。
6 质粒的小量抽提
（1）LB-氨苄青霉素肉汤（见 2. 2 中第 18 项）。
（2）预裂解缓冲液： 5 0 mmol/L 葡萄糖， 2 5 mmol, LTris-HC1， p H 8. 0, lOmmol/LEDTA
（3）RNase A (见 4 中第 14 项）。
（4）碱裂解缓冲液：0. 2 mol/LNaOH， 1% S D S , 该溶液需用之前新鲜配制。
（5）中和缓冲液： 5 m olZL 乙酸钾， 30% 乙酸， 50 mm 〇 r L 葡萄糖， 25 mmol/LTris-HCl， pH 8. 0， 10 mmol/L EDTA0
（6）异 丙 醇（FisherScientific)
7.70% 乙 醇（见 2. 1 中第 5 项）。
7 插入序列的分离
（1）限制性内切酶： E co R I 和 Xho I (N ew EnglandBiolabs); 可根据接头调节。
（2）IOX 限制性内切酶缓冲液，使用限制酶所附带的缓冲液。
（3）DNA 上样缓冲液：0. 25% (W /V ) 二甲苯氰， 0. 25% (W / V ) 溴酚蓝， 50% 甘油。
（4）1% T A E 琼脂胶和 50X T A E 缓 冲 液（见 2. 2 中第 11、 12 项
（5）DNA 分子质量标准（Invitrogen)，由表达克隆片段的大小而定（从 100 bp 到几kb)。
（6）带滤芯的移液器吸头（Im L )。
（7）灭菌棉花或玻璃丝。
