核酸探针标记及原位杂交-4
(三)试剂配制
配制溶液过程中均需戴手套，液体配制均用超净水，所用瓶子均经160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。
1.DEPC水 将DEPC按1‰浓度加入超净水中，充分混合后静置过夜，15~20min高压消毒，之后室温避尘存放。
2.0.1mol PBS pH 7.4
A液：0.1mol NaH2PO4为NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O)1.56g；DEPC水100.00m1。
B液：0.1mol Na2HP04为Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。
A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其浓度达0.85％。
3.20×SSC 为NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L)4.410g；DEPC水50.00m1。
4.4％多聚甲醛(pH 7.4) 为多聚甲醛4g；0.1mol PBS 100m1。
5.缓冲液
（1） 缓冲液Ⅰ(pH 7.5) 为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超净水加至1000ml。
（2） 缓冲液Ⅱ(pH 9.5) 为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超净水加至1000ml。
（3） 缓冲液 Ⅲ(pH 9.5) 为1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超净水加至1000ml。
6.去离子甲酰胺 将阴阳离子交换树脂各5g加入50ml甲酰胺中，待树脂下沉后用上清液。
7.50％硫酸葡聚糖 5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，不断搅动使之完全溶解。
8.50×Denhardt's液 为1％Fico11type 400（聚蔗糖） 0.2g；1％PVP（聚乙烯砒硌烷酮）0.2g；1％BSA（牛血清白蛋白）0.2g；DEPC水 20.0ml。
9.预杂交液 为去离子甲酰胺5.0m1；20×SSC2.0m1；鲑鱼精DNA (10mg/m1)
；0.5ml（沸水变性10min）；酵母tRNA (10mg/m1) 0.25m1；50％硫酸葡聚糖
2.00m1；50×Denhardt?蒺s液 0.20ml。
(四)杂交与显色
1．杂交 将已标记的探针加入预杂交液即成为杂交液（探针浓度为1μg/m1），切片经2×SSC短暂浸洗后，滴加杂交液，于湿盒内置37℃或<42℃孵育过夜。然后依次经2×SSC室温浸洗1h，l×SSC室温浸洗lh，0.5×SSC
37℃浸洗30min，0.5×SSC室温浸洗30min。注意滴加杂交液时切片勿干燥。
2.显色 以下各步均在室温下进行。
（1）缓冲液I洗1min。
（2）用含2%正常羊血清和0.3％TritonX-100的缓冲液I孵育切片30min。
（3）用含1％正常羊血清和0.3％TronX-100的缓冲液I稀释羊抗Dig抗体。
（4）将抗体稀释液滴加在切片上，封口膜覆盖，湿盒内4℃孵育过夜。
（5）缓冲液I洗10min。
（6）缓冲液Ⅱ洗10min。
（7）加显色液，封口膜覆盖，避光室温孵育2～20h，随时镜检，当显色满意时入缓冲液Ⅲ终止显色。
显色液临用前配，其配方为：①NBT 45μl；②X-Phospllate液 35μl；③左旋咪唑 2.4mg；④ 缓冲液Ⅱ 加至10ml。
（8）常规脱水、透明、封固。
结果：杂交阳性信号为紫蓝色颗粒。
(五)原位杂交对照试验
同免疫组织化学染色对照一样，为证明原位杂交实验操作的准确性和实验结果的特异性，需要设置一系列对照实验，具体的各种对照实验的设置及其意义请参考原位杂交专著，以下仅介绍几种常用的对照实验。
1.省去标记探针 在做原位杂交时，以PBS或预杂交液替代杂交液，结果应为阴性，这是一种简便而有意义的阴性对照实验。如省去标记探针仍出现阳性反应，这一定是假阳性。
2.自身对照 用同一组织切片或涂片上与靶序列无关的其他结构作对照。阳性与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。
3.阴性对照 用已知不存在相应靶序列的组织标本杂交，结果应为阴性。阴性对照可排除在杂交过程中由于非特异性杂交反应等因素造成的假阳性结果。
4.阳性对照 用已知含靶序列的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性，称阳性对照。通过阳性对照可证明杂交过程中各个步骤以及所使用的试剂都合乎标准，实验方法可靠。尤其当待检标本为阴性时，阳性对照片呈阳性反应可排除待检标本假阴性的可能。故若预期杂交结果为阴性时，就必须设阳性对照，当阳性对照亦不显色，就证明杂交过程的某一步骤或所用试剂问题。
