应用SpectraMax微孔板检测系统和CyQUANT试剂盒检测细胞增殖1
简介
用荧光方法定量细胞增殖可以简单快速的检测药物或其他实验处理方法对细胞生长的影响。Life Technologies公司的CyQUANT细胞增殖试剂盒是一个敏感性高、可重复并且简便的做荧光微孔板检测的方法。CyQUANT的GR染料可标记到细胞核上，通过荧光来计算细胞个数。DNA与RNA的比例会随着细胞周期的变化而改变，因此，CyQUANT试剂盒可以通过RNA酶溶解产物和核酸量做标准曲线。
本应用介绍了如何应用CyQUANT试剂盒和Molecular Devices公司的SpectraMax微孔板检测系统及SoftMax® Pro软件检测细胞增殖。文中共介绍了两种方法，一种是基于细胞的方法，另一种是将细胞样品用RNA酶溶解后做DNA标准曲线。
优势
- Rapid and convenient quantitation of cell growth
- Sensitive detection of as few as 50 cells
- Easy data analysis with preconfigured SoftMax Pro Software protocol
材料
- CyQUANT 细胞增殖试剂盒 (Life Technologies cat. # C7026)：Component A，400X CyQUANT GR 染料； component B，20X细胞溶解液； component ，100 μL浓度为 100 μg/mL的λ DNA 标准样品溶液
注意： 细胞溶解液和染料稀释后需在几小时内使用，CyQUANT GR染料溶液需避光保存。
- 细胞系： CHO-K1 细胞(ATCC # CCL-61)
- EDTA溶液(Fisher Chemicals cat. # S311-100)
- NaCl 溶液(Fisher Chemicals cat. # S271-500)
- 无DNA酶的RNA酶A或RNA酶混合液(Ambion cat. # 2286)
- 黑色底透96孔板(Corning cat. # 3603)
- 具有荧光检测模块的SpectraMax微孔板读板机 (Molecular Devices)
细胞准备
CyQUANT实验的贴壁或不贴壁细胞可以直接在微孔板中培养细胞然后冷冻，或者在培养皿中培养细胞，然后冷冻细胞样品转移动微孔板中。详细步骤可参考CyQUANT细胞增殖试剂盒产品说明书MP-7026。
基于细胞的CyQUANT实验法
准备细胞
步骤1：用胰酶或EDTA溶液将贴壁细胞消化下来，用培养基将细胞悬液按表中浓度稀释后放入96孔板，对照组为不含细胞的培养基。
步骤2：将孔板置于37℃环境下直到检测增殖的时间。孵育时间取决于细胞类型、增殖检测类型及实验目的。
步骤3：吸出孔中的细胞培养液，用PBS清洗一次，若细胞贴壁不牢可不洗。
步骤4：将孔板置于-70℃冷冻细胞直到检测(至少一小时，长可达数周)。冷冻步骤有利于细胞样品的完全裂解。
制备细胞样品做标准曲线
注意：最好使用与实验中使用的标准曲线相同类型的细胞类型。
步骤1：用胰酶或EDTA溶液将贴壁细胞消化下来，用培养基将细胞悬液稀释至105-106cells/mL。
步骤2：取1mL细胞悬液200g(约1,500rpm)离心5分钟，弃掉上清，将管底离出细胞置于-70℃冷冻直到检测。冷冻步骤有利于细胞样品的完全裂解。
准备试剂
步骤1：制备1X细胞裂解液，用蒸馏水以1:20稀释细胞裂解液储存液，需制备每孔200μL。
步骤2：制备1X CyQUANT GR染液/细胞裂解液，用1X细胞裂解液以1:400稀释CyQUANT GR染液储存液。稀释液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。
制备基于细胞法的标准曲线和样品
步骤1：将之前冷冻的离出细胞放在室温几分钟解冻。加入1mLCyQUANTGR染液/细胞裂解液，涡旋使细胞重悬。假设细胞为106个，细胞裂解液相当于106cells/mL。
步骤2：在孔板中以1:2的稀释梯度放入细胞悬液，最高为50,000cells/mL，最低为24cells/mL。加入CyQUANTGR染液/细胞裂解液使每孔液体终体积为200μl。每个浓度四个重复，并在空余孔中设几个对照组(无细胞)。
步骤3：将微孔板避光放置于室温2-5分钟。
