应用SpectraMax微孔板检测系统和CyQUANT试剂盒检测细胞增殖3
RNA酶处理、基于DNA含量做标准曲线的CyQUANT实验法
细胞增殖同样可以用DNA含量来评价并作出标准曲线。根据细胞曲线可计算出DNA含量，细胞裂解液经过RNA酶处理就排除了RNA对结果的干扰。在本应用说明中，列出了用DNA含量做标准曲线来定量细胞样品的设置步骤。
准备试剂
步骤1：制备1X细胞裂解液，用蒸馏水以1:20稀释细胞裂解液储存液，需制备每孔200μL。一部分细胞裂解液加入1mMEDTA和180mMNaCl，一部分不加EDTA和NaCl。
步骤2：制备1X和2XCyQUANTGR染液/细胞裂解液，用1X细胞裂解液以1:400或1:200稀释CyQUANTGR染液储存液。稀释液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。
在塑料管中制备DNA标准样品
步骤1：用1X细胞裂解液稀释试剂盒中100μg/mLDNA标准样品，稀释成1μg/mL存储液。
步骤2：将DNA存储液按表4所列按梯度稀释。
注意：CyQUANT试剂盒中的是λ噬菌体DNA，本文中的数据都是按标准梯度稀释。对于自己的实验也可选择其他来源的DNA样品，具体操作请参考产品说明书MP-7026。
准备细胞
依据所用的细胞系(贴壁还是不贴壁)，按照Life Technologies的CyQUANT说明书选择适当的细胞培养(微孔板中还是培养皿中)和冻存方法，在-70℃冻存细胞。本文中，贴壁细胞要先从培养皿中消化下来，然后离心，并将离心得到的细胞斑块冻存。
准备细胞样品、标准曲线DNA样品和空白
步骤1：将之前冷冻的离出细胞放在室温几分钟解冻。加入1mLCyQUANTGR染液/细胞裂解液，涡旋使细胞重悬。
步骤2：预处理细胞，每孔中加入含1mMEDTA和180mMNaCl的细胞裂解液，并在4个没有细胞的孔中加入同样的细胞裂解液(空白对照孔)。如果样品为之前冷冻的细胞离心斑块，先用100μL裂解液重悬，然后转移到微孔板中。在有细胞的样品孔和空白对照孔中分别加入4μLRNA酶(每孔两个单位，详见下文)。室温孵育1小时。
注意：无DNA酶的RNA酶处理细胞时浓度不超过10μL中含有饱和活性单位。例如，试剂盒中混合RNA酶浓度为500U/mL，所以每4μL中含有两个活性单位。
步骤3：在有细胞的样品孔和空白对照孔中分别加入100μL2XCyQUANTGR染液/细胞裂解液。
步骤4：将之前准备的DNA梯度稀释液依次加入到微孔板中，孔板中因包含两种对照，一种是加入稀释液但无DNA的空白对照，另一种是只含有1XCyQUANTGR染液/细胞裂解液的孔板空白对照(无DNA和RNA酶)。
步骤5：室温孵育2-5分钟
设置仪器和软件参数
步骤1：打开微孔板读板仪开关，打开SoftMaxPro软件并点击ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夹中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步骤2：按表2中所示参数设置仪器，此设置已在预配置的列表中。
步骤3：使用TemplateEditor设置孔板加样的模板，包括标准样品孔、孔板空白对照孔和样品孔(RNA酶处理的细胞)的位置。
读板和数据分析
步骤1：将微孔板放于读板机中。
步骤2：点击软件的Read键。
步骤3：仪器将对微孔板进行读值后，相关的荧光值(RFUs)将出现在软件的孔板位置，数据将依据设置分析出结果，并显示在Grouptables中。
步骤4：TemplateEditor里设置了标准曲线组的话，DNA标准曲线将会有软件自动生成。
步骤5：在CurveFit下拉菜单里可以选择拟合曲线公式，本应用说明的标准曲线选择的是log-log曲线拟合。
步骤6：软件通过标准曲线公式计算出每个DNA样品的浓度，并显示在Unknownsgroup部分。
DNA标准曲线结果
基于细胞的标准曲线如前文所述，呈现在图3中。在生成标准曲线时采用了log-log拟合算法，图中所示结果是SpectraMaxM5微孔板读板机得到的，MolecularDevices公司的其他具有荧光功能的读板机均可得到相似结果(数据未显示)。用RNA酶处理细胞检测DNA含量做标准曲线的例子现实在表5中。在此应用说明中，一个系列的细胞浓度被计算。事实上，每孔细胞个数在50-50,000个之间(标准曲线范围内)均可用此方法计算得到细胞DNA浓度。
图4显示横坐标为每孔细胞个数，纵坐标为平均DNA含量，曲线范围为50-50,000个细胞，结果如试剂盒说明书所述。图5中显示了RNA酶处理的和未处理的细胞样品RFUs值的比较，说明RNA酶处理会降低细胞裂解液的荧光强度。
总结
CyQUANT细胞增殖实验是快速的、灵敏的检测细胞个数和细胞DNA含量的荧光方法。SpectraMax M5微孔板读板机得到的数据结果与Molecular Devices公司的其他具有荧光功能的读板机得到的结果相似。基于细胞的标准曲线和5分钟的孵育，我们得到了与CyQUANT试剂盒相似的动态范围(50-50,000个细胞)。应用λ DNA样品得到的曲线及通过标准曲线计算DNA含量的下限位50个细胞。结合应用SoftMaxPro的软件分析功能及预置的CyQUANT拍摄设置，提供了一个计算和得到数据便捷的方法。
参考文献
1. Life Technologies Product InformationsheetMP 7026 1/12/01: CyQUANT CellProliferation Assay Kit (C-7026).
