应用MD微孔板读板机和双报告系统检测NF-κB活性（一）
前言
报告基因对于基因表达的研究来说是非常有用的工具，它可以代替要研究的目的基因，从而帮助我们了解目的基因的信号通路和相关的疾病。荧光素酶是最常用的报告基因，使用光度计和化学发光功能的微孔板读板机我们可以很容易的检测到荧光素酶，另一方面，由于在细胞实验中其背景较低，因此具有很高的灵敏度。我们通常用萤火虫荧光素酶表达水平高低反映出我们感兴趣的基因在系统中的地位。而海肾来源的荧光素酶则更常在多荧光实验中作为第二种报告基因，来规范化多种在不同样本中变化较大的指标如转染效率，细胞活力等。
SpectraMax® DuoLuc™ Reporter
试剂盒可以对哺乳动物细胞中的萤火虫和海肾荧光素酶进行高灵敏度的定量。依次向微板孔中加入两种适量的反应试剂即可检测荧光。这种双荧光信号检测系统可以在归一化检测荧光信号(萤火虫荧光)的同时提供持续表达的对照荧光信号(海肾荧光)。运用SpectraMax®
iD5 多功能微孔板读板机、注射器系统和 SmartInject™ 技术可以将实验条件最优化。
在这里我们将展示如何在哺乳动物细胞模型中， 通过双荧光报告检测系统和SpectraMax iD5微孔板读板机来检测核转录因子κB
(NF- κB)的活性。NF- κB是参与细胞进程中许多基因表达的“主要调节者”，如炎症，免疫，分化，增殖和凋亡。肿瘤坏死因子α (TNF-
α)可以激活细胞信号通路来降解NF- κB的抑制剂，从而促使其释放并进入核内，调节数百目的基因的表达。NF-
κB通路的紊乱可以诱发多种疾病，如多发性硬化病，糖尿病，阿尔兹海默病等，因此利用合适的工具加深我们对NF- κB通路的理解是十分必要的。
优势
• 灵敏的双报告系统检测多荧光素酶
• 用对照质粒转染进行均一化，提高结果的准确度
• SoftMax Pro软件的预置模板可简化操作
图1 NF-κB信号通路。TNF-α激活信号层级反应使NF-κB抑制剂IKB降解，并释放NF-κB转录因子。
材料
• SpectraMax 双报告试剂盒(Molecular Devices cat. #R8361)
• HEK 293 细胞系 (ATCC cat. #CRL-1573)
• 培养基: DMEM + 10% fetal bovine serum +penicillin/streptomycin
• pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro] 萤火虫荧光素酶质粒 (Promega cat. #E849A)
• pGL4.75[hRluc/CMV] 海肾荧光素酶质粒(Promega cat. #E693A)
• FuGENE HD 转染试剂盒(Promega cat. #E2311)
• Opti-MEM 低血清培养基(ThermoFisher Scientific cat. #31985062)
• 96孔白板 (Corning cat. #3610)
• TNF-α 10 μg/mL PBS + 1 mg/mL BSA溶液(Sigma cat. #T0157)
• BrightMax 密封薄膜(Excel Scientific cat. #WT-50)
• SpectraMax iD5 多功能微孔板读板机
• 具有 SmartInject技术的注射器系统
表1 转染试剂体积与不同DNA含量的比例。
