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免疫球蛋白纯化技术——盐析法纯化免疫球蛋白

2019.3.28

在大多数情况下，免疫血清、杂交瘤细胞培养上清以及腹水中的抗体需经纯化后再用于各种免疫学检测中去。免疫球蛋白常用的纯化方法有盐析法、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析以及高效液相色谱等方法。（来源：医学基础免疫学实验指导，主编金伯泉李恩善，第1 版，北京：世界图书出版社，1990）

实验方法原理	蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
实验材料	血清
试剂、试剂盒	生理盐水硫酸铵溶液萘氏试剂磷酸盐缓冲盐液磺基水杨酸
仪器、耗材	冰箱离心机搅拌器紫外分光光度计扭力天平粗天平透析袋尼龙绳竹棒、PH试纸镊子剪刀烧杯量筒吸管滴管灭菌小瓶试管
实验步骤	1. 取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50 ％饱和（NH_4）₂SO₄]，4 ℃，3 小时以上，使其充分沉淀 2. 离心（3000 rpm）， 20 分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至X ml。再逐滴加饱和硫酸铵X/2 ml，置4 ℃，3 小时以上［此时（NH_4）₂SO₄的饱和度为33 ％)］ 3. 重复上述第二步过程多次。将末次离心后所得沉淀物以0.02 M PH7.4 PBS溶解至X ml装入透析袋。对PBS充分透析、除盐换液3次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色 4. 将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。方法如下蛋白含量（mg/ml）＝（1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm）×样品稀释度。注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。展开
注意事项	一、影响盐析的因素 1. 蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。 2. 离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50 ％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33 ％时γ球蛋白析出。 3. 盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。 4. PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。 5. 温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25 ℃时较0 ℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。 6. 蛋白质沉淀后宜在4 ℃放3 小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。展开