细胞周期测定实验——流式细胞仪测定法
| 实验方法原理 | 流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。
细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。 |
|---|---|
| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 一、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800 rpm，离心 15 min去上清。
二、PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹匀，务必吹散。
三、用5 mL注射器将细胞吸起，用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）。
四、800 rpm 15 min收集固定细胞，PBS洗2次。
五、用0.4 mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）。
六、加RNase-A约3 uL至终浓度约为50 ug/mL ，37℃水浴消化30 min；
七、加PI约50 uL至终浓度约为65 ug/mL ，在冰浴中避光染色30 min。
八、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。
九、样品分析测定及打印。 展开 |
| 其他 | 一、常见问题
A：我做过乳腺细胞的DNA含量测定，取得组织以后，先处理成单细胞悬液，然后再加70%冰乙醇固定，要保证冰乙醇的最终浓度为50%，这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时，最多可保存一个月，上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的，保存了将近三个星期，结果还可以，变异系数为5%.
2. 实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率，请教几个问题：
Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配吗？
A：RNaseA用PBS配制没有问题，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶，可以一起检测吗？
A：用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的，不用担心。
Q：（3）Triton－x－100是固定剂吧，用了70％的冷乙醇（是4℃吗？），是不是就不用Triton－x－100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定剂，可以用75％的乙醇于-20度固定。
Q：（4）还要设什么内参标准（5％鸡红细胞）吗？
A：对照肯定是需要的，这个根据自己的需要进行设置。
Q：（5）不用试剂盒行不行啊？
A：完全可以不用试剂盒。
以下提供一个自己的实验步骤供参考：
（1）200xg离心10min收集细胞；
（2）弃去上清，PBS漂洗一次，将细胞重悬于预冷的80%乙醇中，-20℃固定24h以上；
（3）进行流式细胞仪检测前，200xg离心10min收集固定后的细胞；
（4）PBS洗涤一次，200xg离心10min收集细胞；
（5）将细胞重悬于含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室温孵育30min；
（6）将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。
3. Q：流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度？
A：其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见，该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在，常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA，所以为了简便实验操作，也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是先加RNA酶37度孵育30min，然后加PI 4度孵育30min。
至于染色时使用4度，是因为低温可减弱分子运动，增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。上流式前细胞用75％乙醇固定行吗？
4. Q：我养肿瘤细胞，测周期。看到帖子说70％乙醇必须用PBS和乙醇配，用水配细胞会碎裂，有帖子说PBS和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用75％乙醇固定，就用买来的现成的瓶装75％乙醇，行吗？必须那么严格吗？
A：先用冷PBS悬浮细胞，大约1-2ml，充分悬浮，使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇，终浓度为70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5. Q：我要做流式分析细胞周期，我大概收集了10的6次方细胞，但细胞在乙醇固定之后，还看到有细胞沉淀的，但PBS洗涤两次之后，就基本没什么细胞沉淀了，上机发现就发现不了细胞了。这是怎么回事啊？怎么解决这个问题啊？
A：很可能是洗细胞的过程中丢失了，解决办法有：
（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机
（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。
（3）离心的转速或时间可稍微增加一点儿
（4）每次加抗体时，吸头最好不要接触液面；混匀时最好不要用吸头吹打，以免吸头挂壁带走部分细胞。 展开 |
