三氯化锑比色法（AOAC法）测定维生素D
1)原理
维生素D在三氯甲烷溶液中,与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物,颜色的深浅与维生素D的浓度成正比,在500nm波长下测定其吸光值。
2)仪器
①可见/紫外分光光度计。
②分离柱。
3)试剂
①三氯化锑(250g/L)-三氯甲烷溶液 将25g干燥的三氯化锑迅速投入装有100mL三氯甲烷的棕色试剂瓶中,振摇,使之溶解,再加入无水硫酸钠10g。用时吸取上层清液。
②三氯化锑三氯甲烷-乙酰氯溶液 在上述试剂①中加入为其体积3%的乙酰氯,摇匀。
③无水乙醚 不含过氧化物,检查方法与处理方法同维生素A和维生素E测定。
④无水乙醇 不含醛类物质,检查方法与处理方法同维生素A和维生素E测定。
⑤石油醚(沸程30～60℃):重蒸。
⑥维生素D标准溶液 称取0.25g维生素D,用三氯甲烷稀释至100mL,此液浓度为2.5mg/mL。临用时以三氯甲烷配制成0.025～2.5μg/mL的标准使用液。
⑦聚乙二醇(PEG)600。
⑧白色硅藻土:Celite545(柱色谱载体)。
⑨氨水。
⑩无水硫酸钠。
⑪氢氧化钾溶液(0.5mol/L)。
⑫中性氧化铝 色谱用,100～200目。在550℃灰化炉中活化5.5h,降温至300℃左右,取出装瓶。冷却后,每100g氧化铝加入4mL水用力振摇,使无块状,瓶口封紧储存于干燥器内,16h后使用。
4)操作方法
(1)试样处理
皂化与提取同维生素A和维生素E的方法,如果试样中有维生素A共存,可用以下方法进行分离纯化。
①分离柱的制备 取一支内径为2.2cm,具有活塞和砂芯板的玻璃色谱柱。第一层:加入1～2g无水硫酸钠,铺平整。第二层:称取15gCelite545置于250mL碘价瓶中,加入80mL石油醚,振摇2min,再加入10mL聚乙二醇(PEG)600,剧烈振摇10min,使其黏合均匀、然后倾入色谱柱内。第三层:加5g中性氧化铝。第四层:加入2～4g无水破酸钠轻轻转动色柱、使第二层的高度保持在12cm左右。
②纯化 先用30～50mL石油醚淋洗分离柱,然后将试样提取液倒入柱内,再用石油继继续淋洗。弃去最初收集的10mL滤液,再用200mL.容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度保持2～3mL/min。将淋洗液移入500mL分液漏斗中,每次加100～150mL水,洗涤3次去除残留的聚乙二醇600,以免与三氢化锦作用形成浑浊物,影响比色),将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后,置于浓缩器中减压浓缩至干或在水浴上用水泵减压抽干,立即加入5mL三氯甲烷溶解备用。
(2)测定
①标准曲线的绘制 准确吸取维生素D标准使用液(浓度视试样中维生素D含量高低而定)0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL于10mL容量瓶内,用三氯甲烷定容。取上述标准比色液各1mL于1cm比色皿中,立即加入三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液3mL,在500mm波长下,于2min内测定吸光度。绘制标准曲线。
②试样测定 吸取试样纯化液1mL于比色皿中,以下操作同标准曲线的绘制。
5)计算
式中 x——试样中维生素D的含量,mg/100g;
ρ——标准曲线上查得试样溶液中维生素D含量,μg/mL,如按国际单位,每国际单位=0.025μg维生素D;
V——试样提取后用三氯甲烷定容的体积,mL;
m——试样质量,g。
6)说明及注意事项
①本方法是AOAC选定的正式方法。本方法不能区分维生素D2和维生素D3测定值是两者的总量。
②食品中维生素D的含量一般很低,而维生素A、维生素E、胆固醇、甾醇等成分的含量往往都大大超过维生素D,严重干扰维生素D的测定,因此,测定前必须经柱色谱除去这些干扰成分。
③操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响,可使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍,并可减少部分醇的干扰。
