微生物拟核体内体外染色观察实验_溴化乙锭染色法
| 实验方法原理 | 如果将微生物细胞裂解，使其拟核（即染色体 DNA）被抽提出来，通过溴化乙淀（ethidium bromide，简称 EB）染色并进行琼脂糖凝胶电泳，便可观察到释放到细胞外的染色体 DNA。EB 是一种扁平分子染料。可特异性插入 DNA 碱基对之间，在紫外线照射下，使 DNA 呈现荧光，因而可观察到凝胶中的染色体 DNA，由于在提取过程中大分子染色体 DNA 的随机断裂，所以经凝胶电泳后形成的是一条不整齐的浓的荧光带。 用 EB 染色法进行的体外观察染色体 DNA 也分两步进行： 1. 将细胞裂解后抽提染色体 DNA； 2. 通过含有 EB 的琼脂糖凝胶电泳在紫外光下观察染色体 DNA 荧光带。 |
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| 实验材料 | |
| 试剂、试剂盒 | TE 缓冲液10% SDS蛋白酶 K（20 mg ml）5 mol L NaClCTAB NaCI酚 氯仿 异戊酵（25:24:1）异丙酵70% 乙醇溴酚蓝加样缓冲液TAE 电泳缓冲液 |
| 仪器、耗材 | |
| 实验步骤 | 1. 取 4.5 ml 大肠杆菌过夜培养液于 5 ml 塑料离心管中，12000 r/min 离心 1～2 min，弃上清。 2. 将细胞沉淀悬浮于 1.7 ml TE 缓冲液中，加入 10% SDS 90 μl 和 20 mg/ml 的蛋白酶 K 9 μl 混匀，37℃ 保湿 1 h。 3. 加入 5 mol/L NaCl 300 μl，充分混匀，再加入 240 μl CTAB/NaCl，混匀，置 65℃ 水浴 10 min。 4. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，12000 r/min 离心 5 min。 5. 将上清水相转入另一洁净的塑料离心管中，加 0.6 倍体积的异丙醇使 DNA 沉淀下来。 6. 快速离心数秒钟，弃上清，用 70% 的乙醇淋洗 DNA 2 次，将 DNA 沉淀经真空干燥后溶于 300 μl TE 缓冲液中。 用此法获得的染色体 DNA 可用于限制性酶切等分子生物学操作。 7. 取少量（约 3～5 μl）提取的 DNA 样品（其余置于-20℃ 保存），加入 3 μl 溴酚蓝加样缓冲液，混匀后上样进行琼脂糖凝胶电泳 1 ～ 2 h。琼脂糖中加有 EB，在电泳过程中，EB 将插入 DNA 分子中。 8. 戴上一次性塑料手套（EB 是强诱变剂）将凝胶取出置于紫外分析仪上观察染色体 DNA 荧光带。 |
| 注意事项 | 必须通过一块普通玻璃或戴上防护眼镜进行现察，以免损伤眼晴。 |
