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基于Q-OT-qIT质谱系统的蛋白质组学快速鉴定（二）

2020.5.18

表1 有效梯度内的采集数据分析

表2 HeLa和酵母样本全蛋白鉴定结果

2.2 HeLa和酵母蛋白质组快速鉴定结果

数据经SEQUEST HT搜库和Percolator卡值, 从1 μg和50 ng HeLa样本中分别鉴定到20860和14100条肽段(q值0.01), 分别对应3865和2877个非冗余蛋白(表2), 而同样的鉴定数量, 目前的报道至少需要2~3h[9]. 另外, 酵母样本共鉴定到15083条肽段(q值0.01), 对应2697个非冗余蛋白(表2).

HeLa数据进一步使用Preview软件分析谱图质量精度(图2). 结果显示, 母离子(m/z)质量精度平均为0 ppm, 子离子质量精度(m/z)平均为0.075 Da. 轨道肼质量偏差基本保持在5 ppm以内, 具有高质量精度和长期稳定的质量轴; 离子阱质量偏差基本保持在±0.2 Da以内, 质量精度良好, 保证了数据的质量与结果可信度.

肽段ATAGDTHLGGEDFDNR的谱图展示了Q-OT-qIT质谱的碎裂效果和灵敏度(图3), 谱图具有丰富的碎片信息、良好的匹配度和较高的灵敏度. 此外, HCD和CID两种碎裂模式效果相当并有着各自的特点: HCD避免了CID的三分之一效应, 低分子量端信息没有丢失, 同时速度比CID快5%; 而CID灵敏度更高, 对低丰度肽段碎裂效果更明显.

2.3 不同碎裂模式和检测方法比较与分析

鉴于不同模式的鉴定效果差异明显, 实验深入考察了HCD/CID碎裂模式和轨道阱/离子阱二级检测方法对鉴定结果的影响. 首先分析了HeLa在OT-HCD-IT, OT-CID-IT和OT-HCD-OT3种模式下的鉴定结果, 比较其互补性. 结果表明, HCD和CID共同鉴定到的肽段占32.7%, 仅一种碎裂模式鉴定到的占67.3%; OT/IT同时检测到的肽段占51.9%, 仅一种质量分析器检测到的占48.1%(图4). CID有三分之一效应, 造成低分子量端的质量歧视, HCD克服了低质量端歧视, 但灵敏度略低于CID; 离子阱具有较高的扫描速度和灵敏度, 而轨道阱的高分辨率与高质量精度有效排除了复杂样本基质的干扰. 因此, 两种碎裂模式和检测方法具有一定的互补性.

实验进一步使用OT-HCD-IT, OT-CID-IT, OT-HCD-OT和OT-CID-OT4种扫描模式, 对酵母样本进行60 min有效梯度采集, 详细比较了不同扫描模式的差异. 其中, 二级IT采用Rapid扫描, OT采用30k分辨率. 鉴定结果以OT-HCD-IT结果为100%归一化(图5). 结果表明, 由于OT-HCD-IT速度最快, 获得的谱图数和鉴定结果最多; CID比HCD慢5%, 因此鉴定结果少5%; OT-HCD-OT为两级高分辨, 一级、二级无法同时运行, 谱图数和蛋白鉴定数分别是二级IT扫描的70%和85%; OT-CID-OT速度最慢, 谱图数和蛋白鉴定数分别是OT-HCD-IT的60%和75%. 此外, 4种扫描模式的谱图解析率相差不大, 表明不同扫描模式对数据质量影响不大.

2.4 离子最大注入时间与自动增益控制(AGC)对结果的影响

利用C-trap控制离子的注入时间和注入数量(自动增益控制)是轨道阱质量分析器的特点, 进入轨道阱的离子数量对检测结果影响很大, 合适的离子数量不仅避免了空间电荷效应, 还能够明显提升谱图质量、动态线性范围和检测线. 实验在OT-HCD-OT模式下设置不同参数对HeLa样本进行分析(二级OT采用15k分辨率), 进一步探索不同的最大注入时间和AGC设置对结果的影响(表2).

鉴定结果表明, 当样本浓度较高(1 μg)时, 离子数量充足, 较小的注入时间和AGC即可获得良好的结果;增加注入时间和AGC反而会降低扫描速度, 减少谱图数量.因此, 参数设置为1.0e5, 35 ms时获得的鉴定数最多(图6A). 当样本浓度很低(50 ng HeLa)时, 需要增加注入时间和AGC以注入更多的离子, 提高灵敏度和谱图质量; 但如果注入时间过长(120和200ms), 谱图数量太少, 也会导致鉴定结果减少.因此, 2.0e5, 60 ms的参数设置获得的鉴定数最多(图6B). 此外, 注入时间越长、离子数量越多, 谱图质量越高, 因此, 离子注入数量与谱图解析率成正比.